Хвала вам што сте посетили Натуре.цом.Верзија претраживача коју користите има ограничену подршку за ЦСС.За најбоље искуство препоручујемо да користите ажурирани прегледач (или онемогућите режим компатибилности у Интернет Екплорер-у).У међувремену, да бисмо обезбедили сталну подршку, приказаћемо сајт без стилова и ЈаваСцрипт-а.
Вектори гена за лечење плућне цистичне фиброзе морају бити усмерени на проводне дисајне путеве, пошто периферна трансдукција плућа нема терапеутски ефекат.Ефикасност вирусне трансдукције је директно повезана са временом боравка носиоца.Међутим, течности за испоруку као што су носачи гена природно дифундују у алвеоле током инхалације, а терапеутске честице било ког облика се брзо уклањају мукоцилијарним транспортом.Продужење времена боравка носилаца гена у респираторном тракту је важно, али је тешко постићи.Магнетне честице коњуговане са носачем које се могу усмерити на површину респираторног тракта могу побољшати регионално циљање.Због проблема са ин виво снимањем, понашање тако малих магнетних честица на површини дисајних путева у присуству примењеног магнетног поља је слабо схваћено.Циљ ове студије је био да се синхротронским имиџингом визуелизује ин виво кретање серије магнетних честица у трахеји анестезираних пацова у циљу проучавања динамике и образаца понашања појединачних и расутих честица ин виво.Затим смо такође проценили да ли би испорука лентивирусних магнетних честица у присуству магнетног поља повећала ефикасност трансдукције у трахеји пацова.Синхротронско рендгенско снимање показује понашање магнетних честица у стационарним и покретним магнетним пољима ин витро и ин виво.Честице се не могу лако превући по површини живих дисајних путева помоћу магнета, али се током транспорта наслаге концентришу у видном пољу, где је магнетно поље најјаче.Ефикасност трансдукције је такође повећана шест пута када су лентивирусне магнетне честице испоручене у присуству магнетног поља.Узети заједно, ови резултати сугеришу да лентивирусне магнетне честице и магнетна поља могу бити вредни приступи за побољшање циљања генског вектора и нивоа трансдукције у проводним дисајним путевима ин виво.
Цистична фиброза (ЦФ) је узрокована варијацијама у једном гену који се зове ЦФ трансмембрански регулатор проводљивости (ЦФТР).ЦФТР протеин је јонски канал који је присутан у многим епителним ћелијама у целом телу, укључујући дисајне путеве, главно место у патогенези цистичне фиброзе.Дефекти у ЦФТР доводе до абнормалног транспорта воде, дехидрације површине дисајних путева и смањене дубине површинског слоја течности дисајних путева (АСЛ).Такође нарушава способност система мукоцилијарног транспорта (МЦТ) да очисти дисајне путеве од удахнутих честица и патогена.Наш циљ је да развијемо лентивирусну (ЛВ) генску терапију за испоруку исправне копије ЦФТР гена и побољшање АСЛ, МЦТ и здравље плућа, и да наставимо са развојем нових технологија које могу мерити ове параметре ин виво1.
ЛВ вектори су једни од водећих кандидата за генску терапију цистичне фиброзе, углавном зато што могу трајно интегрисати терапеутски ген у базалне ћелије дисајних путева (матичне ћелије дисајних путева).Ово је важно јер могу да поврате нормалну хидратацију и клиренс слузи диференцирањем у функционалне генско кориговане површинске ћелије дисајних путева повезане са цистичном фиброзом, што резултира доживотним предностима.Вектори ЛВ морају бити усмерени против проводних дисајних путева, јер ту почиње захватање плућа у ЦФ.Достављање вектора дубље у плућа може довести до алвеоларне трансдукције, али то нема терапеутски ефекат код цистичне фиброзе.Међутим, течности као што су носиоци гена природно мигрирају у алвеоле када се удахну након порођаја3,4 и терапеутске честице се брзо избацују у оралну шупљину помоћу МЦТ.Ефикасност ЛВ трансдукције је директно повезана са дужином времена током којег вектор остаје близу циљних ћелија да би омогућио ћелијско узимање – „време боравка“ 5 које се лако скраћује типичним регионалним протоком ваздуха, као и координисаним уносом слузи и МЦТ честица.За цистичну фиброзу, способност да се продужи време задржавања ЛВ у дисајним путевима је важна за постизање високог нивоа трансдукције у овој области, али је до сада била изазовна.
Да бисмо превазишли ову препреку, предлажемо да ЛВ магнетне честице (МП) могу помоћи на два комплементарна начина.Прво, они могу бити вођени магнетом до површине дисајних путева како би се побољшало циљање и помогло честицама носача гена да буду у правом делу дисајних путева;и АСЛ) прелазе у ћелијски слој 6. МП се широко користе као циљана средства за испоруку лекова када се везују за антитела, лекове за хемотерапију или друге мале молекуле који се везују за ћелијске мембране или се везују за одговарајуће рецепторе ћелијске површине и акумулирају се на местима тумора у присуство статичког електрицитета.Магнетна поља за терапију рака 7. Друге „хипертермичне“ методе имају за циљ убијање туморских ћелија загревањем МП када су изложене осцилирајућим магнетним пољима.Принцип магнетне трансфекције, у коме се магнетно поље користи као средство за трансфекцију за побољшање преноса ДНК у ћелије, обично се користи ин витро коришћењем низа невирусних и вирусних генских вектора за ћелијске линије које се тешко могу трансдуцирати. ..Утврђена је ефикасност магнетотрансфекције ЛВ са испоруком ЛВ МП ин витро у ћелијску линију хуманог бронхијалног епитела у присуству статичког магнетног поља, повећавајући ефикасност трансдукције за 186 пута у поређењу са само ЛВ вектором.ЛВ МТ је такође примењен на ин витро моделу цистичне фиброзе, где је магнетна трансфекција повећала ЛВ трансдукцију у културама интерфејса ваздух-течност за фактор 20 у присуству спутума цистичне фиброзе10.Међутим, магнетотрансфекција органа ин виво је добила релативно мало пажње и процењена је само у неколико студија на животињама11,12,13,14,15, посебно на плућима16,17.Међутим, могућности магнетне трансфекције у плућној терапији цистичне фиброзе су јасне.Тан ет ал.(2020) је навео да ће „студија валидације ефективне плућне испоруке магнетних наночестица утрти пут будућим ЦФТР стратегијама инхалације за побољшање клиничких исхода код пацијената са цистичном фиброзом“6.
Понашање малих магнетних честица на површини респираторног тракта у присуству примењеног магнетног поља тешко је визуелизовати и проучавати, па су стога слабо разумљиве.У другим студијама, развили смо метод за неинвазивно снимање и квантификацију минутних ин виво промена у дубини АСЛ18 и понашању МЦТ19,20 за директно мерење површинске хидратације канала гаса (ПБ-ПЦКСИ). и користи се као рани индикатор ефикасности лечења.Поред тога, наш МЦТ метод оцењивања користи честице пречника 10–35 µм састављене од алуминијума или стакла са високим индексом преламања као МЦТ маркере видљиве са ПБ-ПЦКСИ21.Обе методе су погодне за снимање низа типова честица, укључујући МП.
Због високе просторне и временске резолуције, наши АСЛ и МЦТ тестови засновани на ПБ-ПЦКСИ су веома погодни за проучавање динамике и образаца понашања појединачних и расутих честица ин виво како би нам помогли да разумемо и оптимизујемо методе испоруке МП гена.Приступ који користимо овде је заснован на нашим студијама које користе СПринг-8 БЛ20Б2 беамлине, у којима смо визуализовали кретање течности након испоруке дозе лажног вектора у назалне и плућне дисајне путеве мишева како бисмо објаснили наше хетерогене обрасце експресије гена које смо приметили у нашем гену.студије на животињама са дозом носача од 3.4.
Циљ ове студије је био да се помоћу ПБ-ПЦКСИ синхротрона визуализује ин виво кретања серије МП у трахеји живих пацова.Ове ПБ-ПЦКСИ студије снимања су дизајниране да тестирају серију МП, јачину магнетног поља и локацију како би се утврдио њихов утицај на кретање МП.Претпоставили смо да би спољашње магнетно поље помогло испорученом МФ да остане или се помери у циљно подручје.Ове студије су нам такође омогућиле да одредимо конфигурације магнета које максимизирају количину честица преосталих у трахеји након депозиције.У другој серији студија, имали смо за циљ да искористимо ову оптималну конфигурацију да покажемо образац трансдукције који је резултат ин виво испоруке ЛВ-МП у дисајне путеве пацова, под претпоставком да би испорука ЛВ-МП у контексту циљања дисајних путева резултирала у повећању ефикасности ЛВ трансдукције..
Све студије на животињама спроведене су у складу са протоколима који су одобрили Универзитет у Аделаиди (М-2019-060 и М-2020-022) и Синхротронски комитет за етику животиња СПринг-8.Експерименти су спроведени у складу са препорукама АРРИВЕ.
Све рендгенске слике су снимљене на линији снопа БЛ20КСУ на синхротрону СПринг-8 у Јапану коришћењем подешавања сличног претходно описаном21,22.Укратко, експериментална кутија се налазила 245 м од синхротронског складишног прстена.Удаљеност између узорка и детектора од 0,6 м се користи за студије имиџинга честица и 0,3 м за ин виво студије снимања да би се створили ефекти фазног контраста.Коришћен је монохроматски сноп са енергијом од 25 кеВ.Слике су добијене коришћењем рендгенског претварача високе резолуције (СПринг-8 БМ3) спојеног на сЦМОС детектор.Претварач претвара рендгенске зраке у видљиву светлост помоћу сцинтилатора дебљине 10 µм (Гд3Ал2Га3О12), који се затим усмерава на сЦМОС сензор користећи ×10 (НА 0.3) објектив микроскопа.СЦМОС детектор је био Орца-Фласх4.0 (Хамаматсу Пхотоницс, Јапан) са величином низа од 2048 × 2048 пиксела и сировом величином пиксела од 6,5 × 6,5 µм.Ова поставка даје ефективну изотропну величину пиксела од 0,51 µм и видно поље од приближно 1,1 мм × 1,1 мм.Трајање експозиције од 100 мс је изабрано да би се максимизирао однос сигнал-шум магнетних честица унутар и изван дисајних путева, док су артефакти покрета изазвани дисањем минимизирани.За ин виво студије, брзи рендгенски затварач је постављен на путању рендгенских зрака како би се ограничила доза зрачења блокирањем снопа рендгенског зрака између експозиција.
ЛВ медијум није коришћен ни у једној студији снимања СПринг-8 ПБ-ПЦКСИ јер комора за снимање БЛ20КСУ није сертификована за ниво биолошке безбедности 2.Уместо тога, одабрали смо низ добро окарактерисаних МП од два комерцијална продавца који покривају низ величина, материјала, концентрација гвожђа и примена, — прво да бисмо разумели како магнетна поља утичу на кретање МП у стакленим капиларама, а затим у живих дисајних путева.површине.Величина МП варира од 0,25 до 18 µм и направљена је од различитих материјала (видети табелу 1), али састав сваког узорка, укључујући величину магнетних честица у МП, није познат.На основу наших опсежних МЦТ студија 19, 20, 21, 23, 24, очекујемо да се МПс до 5 µм могу видети на површини трахеалног дисајног пута, на пример, одузимањем узастопних кадрова да би се видела побољшана видљивост покрета МП.Једна МП од 0,25 µм је мања од резолуције уређаја за снимање, али се очекује да ПБ-ПЦКСИ открије њихов волуметријски контраст и кретање површинске течности на коју се таложе након наношења.
Узорци за сваког МП у табели.1 је припремљен у стакленим капиларама од 20 μл (Друммонд Мицроцапс, ПА, САД) унутрашњег пречника од 0, 63 мм.Корпускуларне честице су доступне у води, док су ЦомбиМаг честице доступне у власничкој течности произвођача.Свака епрувета је до пола напуњена течношћу (приближно 11 µл) и постављена на држач узорка (види слику 1).Стаклене капиларе су постављене хоризонтално на сцену у комори за снимање и постављене на ивицама течности.Магнет од никловане шкољке пречника 19 мм (дужине 28 мм) направљен од ретке земље, неодимијума, гвожђа и бора (НдФеБ) (Н35, кат. бр. ЛМ1652, Јаицар Елецтроницс, Аустралија) са остатком од 1,17 Т је причвршћен за засебна табела преноса за постизање Даљински промените своју позицију током рендеровања.Рендгенско снимање почиње када се магнет постави приближно 30 мм изнад узорка и слике се добијају брзином од 4 кадра у секунди.Током снимања, магнет је доведен близу стаклене капиларне цеви (на растојању од око 1 мм), а затим се померао дуж цеви да би се проценио ефекат јачине поља и положаја.
Ин витро сетуп за снимање који садржи МП узорке у стакленим капиларама у фази транслације ки узорка.Путања рендгенског зрака означена је црвеном испрекиданом линијом.
Када је ин витро видљивост МПс установљена, њихова подскупина је тестирана ин виво на женкама Вистар албино пацова дивљег типа (старих 12 недеља, око 200 г).Медетомидин 0,24 мг/кг (Домитор®, Зеноак, Јапан), мидазолам 3,2 мг/кг (Дормицум®, Астеллас Пхарма, Јапан) и буторфанол 4 мг/кг (Веторпхале®, Меији Сеика).Пацови су анестезирани Пхарма (Јапан) смешом интраперитонеалном ињекцијом.Након анестезије, припремљени су за снимање уклањањем крзна око трахеје, убацивањем ендотрахеалне цеви (ЕТ; 16 Га интравенска канила, Терумо БЦТ) и имобилизацијом у лежећем положају на посебно направљеној плочи за снимање која садржи термалну врећу. за одржавање телесне температуре.22. Плоча за снимање је затим причвршћена на степен узорка у кутији за снимање под благим углом да би се трахеја хоризонтално поравнала на рендгенском снимку као што је приказано на слици 2а.
(а) Ин виво подешавање снимања у јединици за снимање СПринг-8, путања рендгенског зрака означена црвеном испрекиданом линијом.(б,ц) Локализација трахеалног магнета извршена је даљински помоћу две ортогонално постављене ИП камере.На левој страни слике на екрану можете видети жичану петљу која држи главу и канилу за испоруку инсталирану унутар ЕТ цеви.
Систем пумпе за шприцеве ​​са даљинским управљањем (УМП2, Ворлд Прецисион Инструментс, Сарасота, ФЛ) помоћу стакленог шприца од 100 µл спојен је на ПЕ10 цев (0,61 мм ОД, 0,28 мм ИД) помоћу игле од 30 Га.Означите цев да бисте били сигурни да је врх у исправном положају у трахеји приликом уметања ендотрахеалне цеви.Користећи микропумпу, клип шприца је уклоњен и врх епрувете је уроњен у МП узорак који треба да се испоручи.Напуњена цев за испоруку је затим уметнута у ендотрахеалну цев, постављајући врх на најјачи део нашег очекиваног примењеног магнетног поља.Стицање слике је контролисано помоћу детектора даха повезаног са нашом кутијом за мерење времена заснованом на Ардуину, а сви сигнали (нпр. температура, дисање, отварање/затварање затварача и аквизиција слике) су снимљени помоћу Поверлаб и ЛабЦхарт (АД Инструментс, Сиднеј, Аустралија) 22 Приликом снимања Када кућиште није било доступно, две ИП камере (Панасониц ББ-СЦ382) биле су постављене под углом од приближно 90° једна према другој и коришћене за контролу положаја магнета у односу на трахеју током снимања (Слика 2б, ц).Да би се минимизирали артефакти покрета, једна слика по даху је добијена током терминалног платоа респираторног протока.
Магнет је причвршћен за други степен, који се може налазити удаљено на спољашњој страни тела за снимање.Тестиране су различите позиције и конфигурације магнета, укључујући: постављене под углом од приближно 30° изнад трахеје (конфигурације су приказане на сликама 2а и 3а);један магнет изнад животиње, а други испод, са половима постављеним за привлачење (слика 3б)., један магнет изнад животиње и један испод, са половима постављеним за одбијање (слика 3ц), и један магнет изнад и окомито на трахеју (слика 3д).Након што поставите животињу и магнет и убаците МП који се тестира у шприц пумпу, дајте дозу од 50 µл брзином од 4 µл/сец по добијању слика.Магнет се затим помера напред-назад дуж или попреко трахеје док наставља да добија слике.
Конфигурација магнета за ин виво снимање (а) један магнет изнад трахеје под углом од приближно 30°, (б) два магнета конфигурисана за привлачење, (ц) два магнета конфигурисана за одбијање, (д) ​​један магнет изнад и окомито на трахеја.Посматрач је гледао од уста до плућа кроз трахеју и рендгенски сноп је прошао кроз леву страну пацова и изашао са десне стране.Магнет се или помера дуж дужине дисајног пута или лево и десно изнад трахеје у правцу рендгенског зрака.
Такође смо настојали да утврдимо видљивост и понашање честица у дисајним путевима у одсуству мешања дисања и откуцаја срца.Стога, на крају периода снимања, животиње су хумано еутаназиране због предозирања пентобарбиталом (Сомнопентил, Питман-Мооре, Васхингтон Цроссинг, САД; ~ 65 мг/кг ип).Неке животиње су остављене на платформи за снимање, а након престанка дисања и откуцаја срца, процес снимања је поновљен, додајући додатну дозу МП уколико МП није био видљив на површини дисајних путева.
Добијене слике су исправљене за равно и тамно поље, а затим састављене у филм (20 кадрова у секунди; 15–25 × нормална брзина у зависности од брзине дисања) коришћењем прилагођене скрипте написане у МАТЛАБ-у (Р2020а, Тхе Матхворкс).
Све студије о испоруци вектора гена ЛВ спроведене су у Центру за лабораторијска истраживања на животињама Универзитета у Аделејду и имале су за циљ да искористе резултате СПринг-8 експеримента како би проценили да ли испорука ЛВ-МП у присуству магнетног поља може да побољша пренос гена ин виво .Да би се проценили ефекти МФ и магнетног поља, третиране су две групе животиња: једној групи је убризган ЛВ МФ са постављањем магнета, а другој групи је убризгана контролна група са ЛВ МФ без магнета.
Вектори гена ЛВ су генерисани коришћењем претходно описаних метода 25, 26 .ЛацЗ вектор експримира нуклеарно локализовани ген бета-галактозидазе покретан конститутивним промотером МПСВ (ЛВ-ЛацЗ), који производи плави производ реакције у трансдукованим ћелијама, видљив на предњим странама и деловима плућног ткива.Титрација је изведена у ћелијским културама ручним бројањем броја ЛацЗ-позитивних ћелија коришћењем хемоцитометра да би се израчунао титар у ТУ/мл.Носачи се криоконзервирају на -80°Ц, одмрзну пре употребе и везују за ЦомбиМаг мешањем 1:1 и инкубацијом на леду најмање 30 минута пре испоруке.
Нормални Спрагуе Давлеи пацови (н = 3/група, ~2-3 анестезирана ип са мешавином од 0,4 мг/кг медетомидина (Домитор, Илиум, Аустралија) и 60 мг/кг кетамина (Илиум, Аустралија) у доби од 1 месеца) ип ) ињекција и нехируршка орална канула са интравенском канилом од 16 Га.Да би се осигурало да ткиво трахеалних дисајних путева добије ЛВ трансдукцију, кондиционирано је коришћењем нашег претходно описаног протокола механичке пертурбације у којем је површина трахеалног дисајног пута аксијално трљана жичаном корпом (Н-круг, нитинол за извлачење камена без врха НТСЕ-022115) -УДХ, Цоок Медицал, САД) 30 стр.28.Затим, око 10 минута након пертурбације у кабинету за биолошку безбедност, извршена је трахеална примена ЛВ-МП.
Магнетно поље коришћено у овом експерименту конфигурисано је слично ин виво рендгенској студији, са истим магнетима који су држани преко трахеје са стентама за дестилацију (Слика 4).Запремина од 50 µл (2 к 25 µл аликвота) ЛВ-МП је испоручена у трахеју (н = 3 животиње) коришћењем пипете са врхом гела као што је претходно описано.Контролна група (н = 3 животиње) је примила исти ЛВ-МП без употребе магнета.Након завршетка инфузије, канила се уклања из ендотрахеалне цеви и животиња се екстубира.Магнет остаје на месту 10 минута пре него што се уклони.Пацовима је субкутано даван мелоксикам (1 мл/кг) (Илиум, Аустралија) након чега је уследило повлачење анестезије интраперитонеалном ињекцијом 1 мг/кг атипамазол хидрохлорида (Антиседан, Зоетис, Аустралија).Пацови су држани на топлом и посматрани до потпуног опоравка од анестезије.
ЛВ-МП уређај за испоруку у биолошком сигурносном кабинету.Можете видети да светлосива Луер-лоцк навлака ЕТ цеви вири из уста, а врх гел пипете приказан на слици се убацује кроз ЕТ цев до жељене дубине у трахеју.
Недељу дана након процедуре примене ЛВ-МП, животиње су хумано жртвоване инхалацијом 100% ЦО2 и експресија ЛацЗ је процењена коришћењем нашег стандардног третмана Кс-гал.Три најкаудална хрскавична прстена су уклоњена како би се осигурало да било какво механичко оштећење или задржавање течности услед постављања ендотрахеалне цеви неће бити укључено у анализу.Сваки душник је исечен по дужини да би се добиле две половине за анализу и стављен у шољу која садржи силиконску гуму (Силгард, Дов Инц) помоћу игле Минутиен (Фине Сциенце Тоолс) да би се визуелизовала луминална површина.Дистрибуција и карактер трансдукованих ћелија потврђени су фронталним фотографисањем коришћењем Никон микроскопа (СМЗ1500) са ДигиЛите камером и софтвером ТЦаптуре (Туцсен Пхотоницс, Кина).Слике су добијене при увећању од 20к (укључујући максималну поставку за пуну ширину душника), при чему је цела дужина трахеје приказана корак по корак, обезбеђујући довољно преклапања између сваке слике да би се слике могле „прошивати“.Слике из сваке трахеје су затим комбиноване у једну композитну слику користећи Цомпосите Имаге Едитор верзија 2.0.3 (Мицрософт Ресеарцх) користећи алгоритам планарног кретања. Подручје ЛацЗ експресије унутар композитних слика трахеје од сваке животиње је квантификовано коришћењем аутоматизоване МАТЛАБ скрипте (Р2020а, МатхВоркс) као што је претходно описано28, коришћењем подешавања од 0,35 < Хуе < 0,58, Сатуратион > 0,15 и Валуе < 0,7. Подручје експресије ЛацЗ унутар композитних слика трахеје од сваке животиње је квантификовано коришћењем аутоматизоване МАТЛАБ скрипте (Р2020а, МатхВоркс) као што је претходно описано28, коришћењем подешавања од 0,35 < Хуе < 0,58, Сатуратион > 0,15 и Валуе < 0,7. Плосадь експрессии ЛацЗ в составних изображениах трахеи от каждого животного количественно определена с использованием автоматизированного сценариа МАТЛАБ (Р2020а, МатхВоркс), как описано ранее28, с использованием настроек 0,35 <оттенок <0,58, насисенность> 0,15 и значение <0 ,7. Подручје експресије ЛацЗ у композитним сликама трахеје сваке животиње је квантификовано коришћењем аутоматизоване МАТЛАБ скрипте (Р2020а, МатхВоркс) као што је претходно описано28 коришћењем подешавања од 0,350,15 и вредност<0,7.如 前所 前所, 使用 自动 матлаб 脚本 (Р2020А, МатхВоркс) 对 来自 每 只 动物 的 来自 每 只 动物 的 气管 气管 表达 中 量化, 使用 0,35 <色调 <0,58, 饱和度> 0,15 和值 <0.7 的 的.如 前所, 自动 自动 матлаб 脚本 ((Р2020А, матхоркс) 来自 每 只 的 气管 复合 图像 的 的 使用 使用 使用 的 使用 使用 使用 0,35 <色调 <0,58,> 0,15 和值 <0.7 的 ..... 。........ Области експрессии ЛацЗ на составних изображениах трахеи каждого животного количественно определали с использованием автоматизированного сценарија МАТЛАБ (Р2020а, МатхВоркс), как описано ранее, с использованием настроек 0,35 <оттенок <0,58, насисенность> 0,15 и значение <0,7 . Области експресије ЛацЗ на композитним сликама трахеје сваке животиње су квантификоване коришћењем аутоматизоване МАТЛАБ скрипте (Р2020а, МатхВоркс) као што је претходно описано коришћењем подешавања од 0,35 < нијанса < 0,58, засићеност > 0,15 и вредност < 0,7.Праћењем контура ткива у ГИМП-у в2.10.24, маска је ручно креирана за сваку композитну слику да би се идентификовала област ткива и спречила било каква лажна детекција изван ткива трахеје.Обојене области са свих композитних слика сваке животиње су сабране да би се добила укупна обојена површина за ту животињу.Осликана површина је затим подељена са укупном површином маске да би се добила нормализована површина.
Свака трахеја је уграђена у парафин и пресечена дебљине 5 µм.Секције су обојене неутралном брзом црвеном бојом 5 минута, а слике су добијене помоћу микроскопа Никон Ецлипсе Е400, ДС-Фи3 камере и софтвера за снимање НИС елемената (верзија 5.20.00).
Све статистичке анализе су обављене у ГрапхПад Присм в9 (ГрапхПад Софтваре, Инц.).Статистичка значајност је постављена на п ≤ 0,05.Нормалност је тестирана коришћењем Схапиро-Вилк теста, а разлике у ЛацЗ бојењу су процењене коришћењем неупареног т-теста.
ПЦКСИ је испитао шест МП описаних у табели 1, а видљивост је описана у табели 2. Два полистиренска МП (МП1 и МП2; 18 µм и 0,25 µм, респективно) нису била видљива помоћу ПЦКСИ-а, али су преостали узорци могли бити идентификовани (примери су приказани на слици 5).МП3 и МП4 су слабо видљиви (10-15% Фе3О4; 0,25 µм и 0,9 µм, респективно).Иако је МП5 (98% Фе3О4; 0,25 µм) садржао неке од најмањих тестираних честица, био је најизраженији.Производ ЦомбиМаг МП6 је тешко разликовати.У свим случајевима, наша способност детекције МФ-а је знатно побољшана померањем магнета напред-назад паралелно са капиларом.Како су се магнети удаљавали од капиларе, честице су извучене у дугим ланцима, али како су се магнети приближавали и јачина магнетног поља се повећавала, ланци честица су се скраћивали како су честице мигрирале према горњој површини капиларе (погледајте Додатни видео С1 : МП4), повећавајући густину честица на површини.Супротно томе, када се магнет уклони из капиларе, јачина поља се смањује и МП-ови се преуређују у дугачке ланце који се протежу од горње површине капиларе (погледајте Додатни видео С2: МП4).Након што магнет престане да се креће, честице настављају да се крећу неко време након достизања равнотежног положаја.Како се МП креће ка горњој површини капиларе и даље од ње, магнетне честице теже да повлаче остатке кроз течност.
Видљивост МП под ПЦКСИ значајно варира између узорака.(а) МП3, (б) МП4, (ц) МП5 и (д) МП6.Све слике приказане овде су снимљене магнетом постављеним приближно 10 мм директно изнад капиларе.Привидни велики кругови су ваздушни мехурићи заробљени у капиларама, јасно показујући црне и беле ивице слике фазног контраста.Црвени оквир означава увећање које појачава контраст.Имајте на уму да пречници магнетних кола на свим сликама нису у размери и да су приближно 100 пута већи од приказаних.
Како се магнет креће лево и десно дуж врха капиларе, угао МП низа се мења да би се поравнао са магнетом (види слику 6), чиме се оцртавају линије магнетног поља.За МП3-5, након што тетива достигне гранични угао, честице се вуку дуж горње површине капиларе.Ово често доводи до групирања МП у веће групе у близини места где је магнетно поље најјаче (погледајте Додатни видео С3: МП5).Ово је такође посебно евидентно када се снима близу краја капиларе, што узрокује да се МП агрегира и концентрише на интерфејсу течност-ваздух.Честице у МП6, које је било теже разликовати од оних у МП3-5, нису се повлачиле када се магнет кретао дуж капиларе, али су се МП жице дисоцирале, остављајући честице на видику (погледајте Додатни видео С4: МП6).У неким случајевима, када је примењено магнетно поље смањено померањем магнета на велику удаљеност од места снимања, сви преостали МП полако су се гравитацијом спуштали на доњу површину цеви, остајући у низу (погледајте Додатни видео С5: МП3) .
Угао МП жице се мења како се магнет помера удесно изнад капиларе.(а) МП3, (б) МП4, (ц) МП5 и (д) МП6.Црвени оквир означава увећање које појачава контраст.Имајте на уму да су додатни видео снимци у информативне сврхе јер откривају важну структуру честица и динамичке информације које се не могу визуелизовати на овим статичним сликама.
Наши тестови су показали да померање магнета напред и назад полако дуж трахеје олакшава визуализацију МФ у контексту сложеног покрета ин виво.Нису обављени ин виво тестови јер полистиренске куглице (МП1 и МП2) нису биле видљиве у капилари.Сваки од преостала четири МФ-а је тестиран ин виво са дугом осом магнета постављеном преко трахеје под углом од око 30° у односу на вертикалу (види слике 2б и 3а), јер је то резултирало дужим МФ ланцима и било је ефикасније него магнет..конфигурација прекинута.МП3, МП4 и МП6 нису пронађени у трахеји ниједне живе животиње.Приликом визуелизације респираторног тракта пацова након хуманог убијања животиња, честице су остале невидљиве чак и када је додата додатна запремина помоћу пумпе за шприц.МП5 је имао највећи садржај оксида гвожђа и био је једина видљива честица, па је коришћен за процену и карактеризацију понашања МП ин виво.
Постављање магнета преко трахеје током уметања МФ-а је довело до тога да су многи, али не сви, МФ-ови концентрисани у видном пољу.Улазак честица у душник најбоље се примећује код хумано еутаназираних животиња.Слика 7 и додатни видео С6: МП5 приказује брзо магнетно хватање и поравнавање честица на површини вентралне трахеје, што указује да МП-ови могу бити циљани на жељена подручја душника.Приликом претраге дисталније дуж трахеје након испоруке МФ, неки МФ су пронађени ближе карини, што указује на недовољну јачину магнетног поља за прикупљање и задржавање свих МФ, пошто су испоручени кроз регион максималне јачине магнетног поља током примене течности.процес.Међутим, постнаталне концентрације МП биле су веће око подручја слике, што сугерише да су многи МП остали у регионима дисајних путева где је примењена јачина магнетног поља била највећа.
Слике (а) пре и (б) након испоруке МП5 у трахеју недавно еутаназираног пацова са магнетом постављеним непосредно изнад области снимања.Приказана област се налази између два хрскавична прстена.Постоји нешто течности у дисајним путевима пре порођаја МП.Црвени оквир означава увећање које појачава контраст.Ове слике су преузете из видео снимка представљеног у С6: МП5 Супплементари Видео.
Померање магнета дуж трахеје ин виво довело је до промене угла МП ланца на површини дисајних путева, слично оном уоченом у капиларама (погледајте слику 8 и додатни видео С7: МП5).Међутим, у нашој студији, МП нису могли да се вуку дуж површине живих респираторних путева, као што то могу капилари.У неким случајевима, МП ланац се продужава како се магнет помера лево-десно.Занимљиво је да смо такође открили да ланац честица мења дубину површинског слоја течности када се магнет помера уздужно дуж трахеје и шири када се магнет помери директно изнад главе и ланац честица ротира у вертикални положај (види Додатни видео С7).: МП5 на 0:09, доле десно).Карактеристичан образац кретања се променио када је магнет померен бочно преко врха трахеје (тј. лево или десно од животиње, а не дуж дужине трахеје).Честице су и даље биле јасно видљиве током њиховог кретања, али када је магнет уклоњен из трахеје, врхови низова честица постали су видљиви (погледајте Додатни видео С8: МП5, почевши од 0:08).Ово се слаже са уоченим понашањем магнетног поља под дејством примењеног магнетног поља у стакленој капилари.
Примери слика које приказују МП5 у трахеји живог анестезираног пацова.(а) Магнет се користи за добијање слика изнад и лево од трахеје, затим (б) након померања магнета удесно.Црвени оквир означава увећање које појачава контраст.Ове слике су из видео снимка представљеног у С7-овом додатном видеу: МП5.
Када су два пола подешена у оријентацији север-југ изнад и испод трахеје (тј. привлачења; слика 3б), МП акорди су изгледали дуже и налазили су се на бочном зиду душника, а не на дорзалној површини трахеје. трахеја (видети Додатак).Видео С9:МП5).Међутим, високе концентрације честица на једном месту (тј. на дорзалној површини трахеје) нису откривене након давања течности помоћу уређаја са двоструким магнетом, што се обично дешава са уређајем са једним магнетом.Затим, када је један магнет био конфигурисан да одбија супротне полове (слика 3ц), број честица видљивих у видном пољу није се повећао након испоруке.Постављање обе две магнетне конфигурације је изазовно због велике јачине магнетног поља које привлачи или гура магнете.Подешавање је затим промењено на један магнет који је паралелан са дисајним путевима, али који пролази кроз дисајне путеве под углом од 90 степени, тако да су линије силе прелазиле преко зида трахеје ортогонално (слика 3д), оријентација која је намењена да се утврди могућност агрегације честица на бочни зид.бити посматран.Међутим, у овој конфигурацији није било препознатљивог кретања МФ акумулације или кретања магнета.На основу свих ових резултата изабрана је конфигурација са једним магнетом и оријентацијом од 30 степени за ин виво студије носилаца гена (слика 3а).
Када је животиња снимљена више пута одмах након што је хумано жртвована, одсуство ометајућег кретања ткива значило је да су се финије, краће линије честица могле уочити у јасном међухрскавичном пољу, које се 'љуљају' у складу са транслационим кретањем магнета.јасно виде присуство и кретање МП6 честица.
Титар ЛВ-ЛацЗ био је 1,8 к 108 ИУ/мЛ, а након мешања 1:1 са ЦомбиМаг МП (МП6), животињама је убризгано 50 µл трахеалне дозе од 9 к 107 ИУ/мл ЛВ вехикулума (тј. 4,5 к 106 ТУ/пацов).).).У овим студијама, уместо да померамо магнет током порођаја, фиксирали смо магнет у једној позицији да бисмо утврдили да ли се ЛВ трансдукција може (а) побољшати у поређењу са векторском испоруком у одсуству магнетног поља, и (б) да ли би дисајни пут могао бити фокусиран.Ћелије које се трансдуцирају у магнетним циљним подручјима горњих дисајних путева.
Чини се да присуство магнета и употреба ЦомбиМаг-а у комбинацији са ЛВ векторима нису негативно утицали на здравље животиња, као што је то учинио наш стандардни протокол за испоруку вектора ЛВ.Фронталне слике трахеалног региона подвргнутог механичкој пертурбацији (допунска слика 1) показале су да је група третирана ЛВ-МП имала значајно више нивое трансдукције у присуству магнета (слика 9а).Само мала количина плавог ЛацЗ бојења била је присутна у контролној групи (слика 9б).Квантификација нормализованих региона обојених Кс-Гал-ом показала је да је примена ЛВ-МП у присуству магнетног поља резултирала приближно шестоструким побољшањем (слика 9ц).
Пример композитних слика које приказују трахеалну трансдукцију са ЛВ-МП (а) у присуству магнетног поља и (б) у одсуству магнета.(ц) Статистички значајно побољшање нормализоване области ЛацЗ трансдукције у трахеји уз употребу магнета (*п = 0,029, т-тест, н = 3 по групи, средња вредност ± стандардна грешка средње вредности).
Неутрални брзи црвено обојени делови (пример приказан на додатној слици 2) указују на то да су ћелије обојене ЛацЗ-ом присутне у истом узорку и на истој локацији као што је претходно пријављено.
Кључни изазов у ​​генској терапији дисајних путева остаје прецизна локализација честица носача у областима од интереса и постизање високог нивоа ефикасности трансдукције у покретним плућима у присуству протока ваздуха и активног клиренса слузи.За ЛВ носаче намењене лечењу респираторних обољења код цистичне фиброзе, повећање времена задржавања честица носача у проводним дисајним путевима до сада је био недостижан циљ.Као што су истакли Кастелани и сарадници, употреба магнетних поља за побољшање трансдукције има предности у односу на друге методе испоруке гена, као што је електропорација, јер може комбиновати једноставност, економичност, локализовану испоруку, повећану ефикасност и краће време инкубације.и евентуално нижа доза вехикулума10.Међутим, ин виво таложење и понашање магнетних честица у дисајним путевима под утицајем спољашњих магнетних сила никада није описано, а заправо способност ове методе да повећа нивое експресије гена у нетакнутим живим дисајним путевима није демонстрирана ин виво.
Наши ин витро експерименти на ПЦКСИ синхротрону су показали да су све честице које смо тестирали, са изузетком МП полистирена, биле видљиве у поставци за снимање коју смо користили.У присуству магнетног поља, магнетна поља формирају низове, чија је дужина повезана са врстом честица и јачином магнетног поља (тј. близином и кретањем магнета).Као што је приказано на слици 10, жице које посматрамо се формирају како свака појединачна честица постаје магнетизована и индукује сопствено локално магнетно поље.Ова одвојена поља узрокују да се друге сличне честице скупљају и повезују са групним кретањима струна због локалних сила из локалних сила привлачења и одбијања других честица.
Дијаграм који приказује (а, б) ланце честица које се формирају унутар капилара испуњених течношћу и (ц, д) трахеју испуњену ваздухом.Имајте на уму да капилари и трахеја нису нацртани у размери.Панел (а) такође садржи опис МФ који садржи честице Фе3О4 распоређене у ланце.
Када се магнет померио преко капиларе, угао низа честица достигао је критични праг за МП3-5 који садржи Фе3О4, након чега низ честица више није остајао у свом првобитном положају, већ се померао дуж површине у нови положај.Магнет.Овај ефекат се вероватно јавља зато што је површина стаклене капиларе довољно глатка да омогући ово кретање.Занимљиво је да се МП6 (ЦомбиМаг) није понашао на овај начин, можда зато што су честице биле мање, имале другачији премаз или површински набој, или је власничка течност носача утицала на њихову способност кретања.Контраст на ЦомбиМаг слици честица је такође слабији, што сугерише да течност и честице могу имати исту густину и да се стога не могу лако померати једна према другој.Честице се такође могу заглавити ако се магнет креће пребрзо, што указује да јачина магнетног поља не може увек да превазиђе трење између честица у течности, што сугерише да јачина магнетног поља и растојање између магнета и циљне области не би требало да буду изненађење.важно.Ови резултати такође показују да иако магнети могу ухватити многе микрочестице које теку кроз циљно подручје, мало је вероватно да се на магнете може ослонити да померају ЦомбиМаг честице дуж површине трахеје.Стога смо закључили да ин виво ЛВ МФ студије треба да користе статичка магнетна поља да би физички циљале одређене области стабла дисајних путева.
Једном када се честице унесу у тело, тешко их је идентификовати у контексту сложеног покретног ткива тела, али њихова способност детекције је побољшана померањем магнета хоризонтално преко трахеје да би се „померале“ МП жице.Иако је снимање у реалном времену могуће, лакше је уочити кретање честица након што је животиња хумано убијена.Концентрације МП су обично биле највеће на овој локацији када је магнет био позициониран преко подручја снимања, иако су се неке честице обично налазиле даље у трахеји.За разлику од ин витро студија, честице се не могу повући низ трахеју кретањем магнета.Овај налаз је у складу са начином на који слуз која покрива површину трахеје типично обрађује удахнуте честице, хватајући их у слуз и потом их чисти кроз механизам муко-цилијарног клиренса.
Претпоставили смо да би коришћење магнета изнад и испод трахеје за привлачење (слика 3б) могло резултирати уједначенијим магнетним пољем, а не магнетним пољем које је високо концентрисано у једној тачки, што потенцијално доводи до уједначеније расподеле честица..Међутим, наша прелиминарна студија није пронашла јасне доказе који подржавају ову хипотезу.Слично томе, постављање пара магнета на одбијање (слика 3ц) није довело до више таложења честица у области слике.Ова два налаза показују да подешавање са двоструким магнетом не побољшава значајно локалну контролу усмеравања МП и да је резултујуће јаке магнетне силе тешко подесити, што овај приступ чини мање практичним.Слично томе, оријентација магнета изнад и преко трахеје (слика 3д) такође није повећала број честица преосталих у области на слици.Неке од ових алтернативних конфигурација можда неће бити успешне јер резултирају смањењем јачине магнетног поља у зони таложења.Дакле, конфигурација једног магнета на 30 степени (слика 3а) се сматра најједноставнијим и најефикаснијим ин виво методом испитивања.
ЛВ-МП студија је показала да када су ЛВ вектори комбиновани са ЦомбиМаг-ом и испоручени након што су били физички поремећени у присуству магнетног поља, нивои трансдукције су се значајно повећали у трахеји у поређењу са контролама.На основу студија синхротронске слике и ЛацЗ резултата, чинило се да је магнетно поље у стању да задржи ЛВ у трахеји и смањи број векторских честица које су одмах продрле дубоко у плућа.Таква побољшања циљања могу довести до веће ефикасности уз смањење испоручених титара, нециљане трансдукције, инфламаторних и имуних нежељених ефеката и трошкова трансфера гена.Важно је да се према произвођачу, ЦомбиМаг може користити у комбинацији са другим методама преноса гена, укључујући друге вирусне векторе (као што је ААВ) и нуклеинске киселине.