Хвала вам што сте посетили Натуре.цом.Верзија претраживача коју користите има ограничену подршку за ЦСС.За најбоље искуство препоручујемо да користите ажурирани прегледач (или онемогућите режим компатибилности у Интернет Екплорер-у).У међувремену, да бисмо обезбедили сталну подршку, приказаћемо сајт без стилова и ЈаваСцрипт-а.
Токопласма гондии је интрацелуларни протозојски паразит који модулира микроокружење инфицираног домаћина и познато је да је повезан са инциденцијом раста тумора на мозгу.У овој студији претпостављамо да егзосомална миРНА-21 из инфекције Токопласма промовише раст тумора мозга.Егзозоми из БВ2 микроглије инфициране токсоплазмом су окарактерисани и потврђена је интернализација ћелија глиома У87.Профили експресије егзосомалне микроРНК анализирани су коришћењем низа микроРНК и микроРНА-21А-5п повезаних са Токопласма гондии и сортирањем тумора.Такође смо истраживали нивое мРНК гена повезаних са тумором у ћелијама глиома У87 тако што смо мењали нивое миР-21 у егзозомима и ефекат егзозома на пролиферацију ћелија глиома У87 код људи.У егзозомима ћелија глиома У87 инфицираних Токопласма гондии, експресија микроРНА-21 је повећана и активност антитуморских гена (ФокО1, ПТЕН и ПДЦД4) је смањена.Егзозоми добијени од БВ2 инфицирани токсоплазмом индукују пролиферацију ћелија глиома У87.Егзозоми индукују раст ћелија У87 у моделу тумора миша.Предлажемо да повећани егзосомални миР-21 у микроглији БВ2 инфицираној токсоплазмом може играти важну улогу као промотор раста ћелија у ћелијама глиома У87 тако што смањује регулацију антитуморских гена.
Процењује се да је више од 18,1 милиона случајева узнапредовалог карцинома дијагностиковано широм света у 2018. години, са око 297.000 дијагностикованих тумора централног нервног система сваке године (1,6% свих тумора)1.Претходна истраживања су показала да фактори ризика за развој тумора на људском мозгу укључују различите хемијске производе, породичну историју и јонизујуће зрачење из терапијске и дијагностичке опреме главе.Међутим, тачан узрок ових малигнитета није познат.Отприлике 20% свих карцинома широм света узроковано је инфективним агенсима, укључујући вирусе, бактерије и паразите3,4.Инфективни патогени ометају генетске механизме ћелије домаћина, као што су поправка ДНК и ћелијски циклус, и могу довести до хроничне упале и оштећења имуног система5.
Инфективни агенси повезани са људским раком су најчешћи вирусни патогени, укључујући хумане папилома вирусе и вирусе хепатитиса Б и Ц.Паразити такође могу играти потенцијалну улогу у развоју рака код људи.Неколико врста паразита, наиме Сцхистосома, Описхорцхис виверрини, О. фелинеус, Цлонорцхис синенсис и Хименолепис нана, умешане су у различите врсте рака код људи 6,7,8.
Токопласма гондии је интрацелуларна протозоа која регулише микроокружење инфицираних ћелија домаћина.Процењује се да овај паразит инфицира око 30% светске популације, што доводи целу популацију у опасност9,10.Токопласма гондии може инфицирати виталне органе, укључујући централни нервни систем (ЦНС), и изазвати озбиљне болести као што су фатални менингитис и енцефалитис, посебно код имунокомпромитованих пацијената9.Међутим, Токопласма гондии такође може да промени окружење зараженог домаћина модулацијом раста ћелија и имунолошких одговора код имунокомпетентних појединаца, што доводи до одржавања асимптоматске хроничне инфекције9,11.Занимљиво, имајући у виду корелацију између преваленције Т. гондии и инциденције тумора на мозгу, неки извештаји сугеришу да ин виво промене животне средине домаћина услед хроничне инфекције Т. гондии личе на микроокружење тумора.
Егзозоми су познати као међућелијски комуникатори који испоручују биолошки садржај, укључујући протеине и нуклеинске киселине, из суседних ћелија16,17.Егзозоми могу утицати на биолошке процесе повезане са тумором, као што су анти-апоптоза, ангиогенеза и метастазе у микроокружењу тумора.Конкретно, миРНА (миРНА), мале некодирајуће РНК дужине око 22 нуклеотида, су важни пост-транскрипциони регулатори гена који контролишу више од 30% људске мРНК преко миРНА-индукованог комплекса за утишавање (миРИСЦ).Токопласма гондии може пореметити биолошке процесе контролисањем експресије миРНА у инфицираним домаћинима.МиРНА домаћина садрже важне сигнале за регулисање биолошких процеса домаћина како би се постигла стратегија преживљавања паразита.Стога, проучавање промена у профилу миРНА домаћина након инфекције са Т. гондии може нам помоћи да јасније разумемо интеракцију између домаћина и Т. гондии.Заиста, Тхиругнанам ет ал.15 сугерише да Т. гондии промовише канцерогенезу мозга мењајући његову експресију на специфичним миРНК домаћина повезаним са растом тумора и открио је да Т. гондии може изазвати глиоме код експерименталних животиња.
Ова студија се фокусира на промену егзосомалног миР-21 у микроглију домаћина инфицираној Токопласма БВ2.Приметили смо могућу улогу измењеног егзосомалног миР-21 у расту ћелија глиома У87 због задржавања у језгру ФокО1/п27, који је мета прекомерно експресираног миР-21.
Егзозоми изведени из БВ2 су добијени коришћењем диференцијалног центрифугирања и валидирани различитим методама да би се спречила контаминација ћелијским компонентама или другим везикулама.СДС-полиакриламид гел електрофореза (СДС-ПАГЕ) показала је различите обрасце између протеина екстрахованих из БВ2 ћелија и егзозома (Слика 1А), а узорци су процењени на присуство Алик-а, који је анализиран Вестерн блот-ом егзосомалних протеинских маркера у .Алик обележавање је пронађено у протеинима егзозома, али не и у протеинима БВ2 ћелијског лизата (слика 1Б).Поред тога, пречишћена РНК из егзозома изведених из БВ2 је анализирана коришћењем биоанализера.18С и 28С рибозомске подјединице су ретко примећене у обрасцу миграције егзосомалне РНК, што указује на поуздану чистоћу (Слика 1Ц).Коначно, трансмисиона електронска микроскопија је показала да су посматрани егзосоми били величине око 60–150 нм и да су имали структуру налик чаши типичној за морфологију егзосома (слика 1Д).
Карактеризација егзосома изведених из БВ2 ћелија.(А) Страница са сигурносним подацима.Протеини су изоловани из БВ2 ћелија или егзозома изведених из БВ2.Протеински обрасци се разликују између ћелија и егзосома.(Б) Вестерн блот анализа егзозомалног маркера (Алик).(Ц) Процена пречишћене РНК из БВ2 ћелија и егзозома добијених из БВ2 коришћењем биоанализера.Дакле, 18С и 28С рибозомске подјединице у БВ2 ћелијама су ретко пронађене у егзосомалној РНК.(Д) Трансмисиона електронска микроскопија је показала да су егзосоми изоловани из БВ2 ћелија негативно обојени са 2% уранил ацетата.Егзозоми су величине приближно 60-150 нм и у облику чаше (Сонг и Јунг, необјављени подаци).
Ћелијска интернализација егзозома изведених из БВ2 у ћелије хуманог глиома У87 примећена је коришћењем конфокалне микроскопије.Егзозоми обележени ПКХ26 су локализовани у цитоплазми У87 ћелија.Језгра су обојена ДАПИ (слика 2А), што указује да егзозоми добијени БВ2 могу бити интернализовани од стране ћелија домаћина и утичу на окружење ћелија примаоца.
Интернализација егзозома добијених из БВ2 у ћелије глиома У87 и егзозома добијених од БВ2 инфицираних Токопласма РХ изазвала је пролиферацију У87 ћелија глиома.(А) Егзозоми обухваћени ћелијама У87 мерени конфокалном микроскопијом.Ћелије глиома У87 су инкубиране са егзозомима обележеним са ПКХ26 (црвено) или без контроле током 24 сата.Језгра су обојена ДАПИ (плаво), а затим посматрана под конфокалним микроскопом (скала бар: 10 μм, к 3000).(Б) Пролиферација ћелија глиома У87 одређена је тестом пролиферације ћелија.Ћелије глиома У87 су третиране егзозомима за назначено време. *П < 0,05 добијено је Студентовим т тестом. *П < 0,05 добијено је Студентовим т тестом. *П < 0,05 получено по т-критериу Стьудента. *П < 0,05 према Студентовом т-тесту. *П < 0,05 通过学生т 检验获得。 *П < 0,05 * П < 0,05, полученниј с помосьу т-критериа Стьудента. * П < 0,05 добијено коришћењем Студентовог т-теста.
Након што смо потврдили интернализацију егзозома изведених из БВ2 у ћелије глиома У87, извршили смо тестове пролиферације ћелија да бисмо истражили улогу егзозома изведених из БВ2 из токсоплазме у развоју ћелија хуманог глиома.Третман ћелија У87 егзозомима из БВ2 ћелија инфицираних Т. гондии показао је да егзозоми добијени од БВ2 Т. гондии изазивају значајно већу пролиферацију ћелија У87 у поређењу са контролом (слика 2Б).
Поред тога, раст ћелија У118 имао је исте резултате као У87, пошто су егзозоми стимулисани Токсоплазмом изазвали највише нивое пролиферације (подаци нису приказани).На основу ових података, можемо указати да егзосоми инфицирани токсоплазмом, добијени БВ2, играју важну улогу у пролиферацији ћелија глиома.
Да бисмо истражили ефекат егзозома БВ2 инфицираних токсоплазмом на развој тумора, убризгали смо ћелије глиома У87 голим мишевима за модел ксенографта и убризгали егзозоме изведене из БВ2 или егзозоме инфициране БВ2.Након што су тумори постали очигледни након 1 недеље, свака експериментална група од 5 мишева је подељена према величини тумора да би се одредила иста почетна тачка, а величина тумора је мерена током 22 дана.
Код мишева са моделом ксенотрансплантата У87, примећена је значајно већа величина и тежина тумора у групи егзозома инфицираних БВ2 РХ 22. дана (Слика 3А, Б).С друге стране, није било значајне разлике у величини тумора између групе егзозома изведене из БВ2 и контролне групе након третмана егзозомима.Поред тога, мишеви којима су убризгане ћелије глиома и егзозоми визуелно су приказали највећи волумен тумора у групи егзозома који су добијени од БВ2 инфицираних РХ (слика 3Ц).Ови резултати показују да егзозоми инфицирани токсоплазмом изведени из БВ2 индукују раст глиома у моделу тумора миша.
Онкогенеза (АЦ) егзозома изведених из БВ2 у моделу миша У87 ксенографта.Величина тумора (А) и тежина (Б) су значајно повећане код БАЛБ/ц голих мишева лечених егзозомима инфицираним РХ, добијеним из БВ2.БАЛБ/ц голим мишевима (Ц) је субкутано убризгано 1 к 107 У87 ћелија суспендованих у Матригел смеши.Шест дана након ињекције, 100 μг егзосома добијених из БВ2 третирано је код мишева.Величина и тежина тумора су мерене у назначеним данима и након жртвовања, респективно. *П < 0,05. *П < 0,05. *Р < 0,05. *П < 0,05. *П < 0,05. *П < 0,05. *Р < 0,05. *П < 0,05.
Подаци су показали да је 37 миРНА (16 прекомерно експримираних и 21 смањено) повезаних са развојем имунитета или тумора значајно измењено у микроглијама након инфекције сојем Токопласма РХ (слика 4А).Релативни нивои експресије миР-21 међу измењеним миРНА су потврђени РТ-ПЦР у реалном времену у егзозомима изведеним из БВ2, егзозомима третираним БВ2 и У87 ћелијама.Експресија миР-21 показала је значајно повећање егзозома из БВ2 ћелија инфицираних Токопласма гондии (РХ сој) (слика 4Б).Релативни нивои експресије миР-21 у БВ2 и У87 ћелијама су се повећали након узимања измењених егзозома (слика 4Б).Релативни нивои експресије миР-21 у можданим ткивима пацијената са тумором и мишева инфицираних Токопласма гондии (МЕ49 сој) били су виши него код контрола (слика 4Ц).Ови резултати корелирају са разликама између нивоа експресије предвиђених и потврђених микроРНА ин витро и ин виво.
Промене у експресији егзосомалног миП-21а-5п у микроглијама инфицираним Токопласма гондии (РХ).(А) Показује значајне промене у сиРНА повезане са имунитетом или развојем тумора након инфекције Т. гондии РХ.(Б) Релативни нивои експресије миР-21 детектовани су РТ-ПЦР-ом у реалном времену у егзозомима добијеним од БВ2, егзозомима третираним БВ2 и ћелијама У87.(Ц) Релативни нивои експресије миР-21 пронађени су у можданим ткивима пацијената са тумором (Н=3) и мишева инфицираних Токопласма гондии (МЕ49 сој) (Н=3). *П < 0,05 добијено је Студентовим т тестом. *П < 0,05 добијено је Студентовим т тестом. *П < 0,05 било получено с помосьу т-критериа Стьудента. *П < 0,05 добијено је коришћењем Студентовог т-теста. *П < 0,05 通过学生т 检验获得。 *П < 0,05 * П <0,05, полученниј с помосьу т-критериј Стьудента. * П < 0,05 добијено коришћењем Студентовог т-теста.
Егзозоми из РХ-инфицираних БВ2 ћелија довели су до раста глиома ин виво и ин витро (сл. 2, 3).Да бисмо открили релевантне мРНК, испитали смо нивое мРНК антитуморских циљних гена, кутију вилице О1 (ФокО1), ПТЕН и програмирану ћелијску смрт 4 (ПДЦД4) у У87 ћелијама инфицираним егзозомима изведеним из БВ2 или РХ БВ2.Биоинформатичка анализа је показала да неколико гена повезаних са тумором, укључујући гене ФокО1, ПТЕН и ПДЦД4, имају миР-2121,22 места везивања.Нивои мРНА антитуморских циљних гена смањени су у егзозомима који су добијени од БВ2 РХ у поређењу са егзозомима добијеним од БВ2 (слика 5А).ФокО1 је показао смањене нивое протеина у егзозомима инфицираним БВ2 у поређењу са егзозомима добијеним од БВ2 (слика 5Б).На основу ових резултата, могли бисмо потврдити да егзосоми изведени из РХ-инфицираног БВ2 смањују антионкогене гене, задржавајући своју улогу у расту тумора.
Токсоплазма РХ-инфицирани егзозоми изведени из БВ2 индукују супресију антитуморских гена у У87 ћелијама глиома егзозомима који су инфицирани Токопласма РХ из БВ2.(А) ПЦР у реалном времену експресије ФокО1, ПТЕН и ПДЦД4 у егзозомима изведеним из БВ2 инфицираних Т. гондии РХ у поређењу са егзозомима ПБС.β-актинска мРНА је коришћена као контрола.(Б) Експресија ФокО1 је одређена Вестерн блоттингом, а подаци дензитометрије су статистички процењени коришћењем програма ИмагеЈ. *П < 0,05 добијено је Студентовим т тестом. *П < 0,05 добијено је Студентовим т тестом. *П < 0,05 било получено с помосьу т-критериа Стьудента. *П < 0,05 добијено је коришћењем Студентовог т-теста. *П < 0,05 通过学生т 检验获得。 *П < 0,05 * П <0,05, полученниј с помосьу т-критериј Стьудента. * П < 0,05 добијено коришћењем Студентовог т-теста.
Да би се разумео ефекат миП-21 у егзозомима на регулацију гена повезану са тумором, ћелије У87 су трансфектоване инхибитором миП-21 коришћењем Липофецтамина 2000 и ћелије су сакупљене 24 сата након трансфекције.Нивои експресије ФокО1 и п27 у ћелијама трансфицираним миР-21 инхибиторима су упоређени са ћелијама третираним егзозомима изведеним из БВ2 коришћењем кРТ-ПЦР (слика 6А,Б).Трансфекција миР-21 инхибитора у ћелије У87 значајно је смањила експресију ФокО1 и п27 (Слика 6).
РХ-инфицирани егзосомални миП-21 изведен из БВ2 изменио је експресију ФокО1/п27 у ћелијама глиома У87.У87 ћелије су трансфектоване миП-21 инхибитором коришћењем Липофецтамина 2000 и ћелије су сакупљене 24 сата након трансфекције.Нивои експресије ФокО1 и п27 у ћелијама трансфицираним миР-21 инхибиторима су упоређени са нивоима у ћелијама третираним егзозомима изведеним из БВ2 коришћењем кРТ-ПЦР (А, Б).
Да би избегао имунолошки одговор домаћина, паразит Токопласма се трансформише у ткивну цисту.Они паразитирају у различитим ткивима, укључујући мозак, срце и скелетне мишиће, током живота домаћина и модулирају имуни одговор домаћина.Поред тога, они могу регулисати ћелијски циклус и апоптозу ћелија домаћина, промовишући њихову пролиферацију14,24.Токопласма гондии претежно инфицира дендритске ћелије домаћина, неутрофиле и лозу моноцита/макрофага, укључујући микроглију мозга.Токопласма гондии индукује диференцијацију макрофага М2 фенотипа, утиче на зарастање рана након инфекције патогеном, а такође је повезана са хиперваскуларизацијом и грануломатозном фиброзом.Ова бихејвиорална патогенеза инфекције токсоплазмом може бити повезана са маркерима повезаним са развојем тумора.Непријатељско окружење које регулише токсоплазма може личити на одговарајући преканцером.Стога се може претпоставити да инфекција токсоплазмом треба да допринесе развоју тумора мозга.У ствари, забележене су високе стопе инфекције токсоплазмом у серуму пацијената са различитим туморима мозга.Поред тога, Токопласма гондии може бити још један карциногени ефектор и делује синергистички како би помогао другим инфективним канцерогенима да развију туморе мозга.С тим у вези, вреди напоменути да П. фалципарум и Епстеин-Барр вирус синергистички доприносе настанку Буркитовог лимфома.
Улога егзосома као регулатора у области истраживања рака је опширно истражена.Међутим, улога егзосома између паразита и заражених домаћина остаје слабо схваћена.До сада су различити регулатори, укључујући излучене протеине, објаснили биолошке процесе помоћу којих се протозојски паразити одупиру нападу домаћина и одржавају инфекцију.Недавно је све већи концепт да микровезикуле повезане са протозоама и њихове микроРНК комуницирају са ћелијама домаћинима како би створиле повољно окружење за њихов опстанак.Стога су потребне даље студије да би се открила веза између измењених егзосомалних миРНА и пролиферације ћелија глиома.Промена микроРНА (кластер гени миР-30ц-1, миР-125б-2, миР-23б-27б-24-1 и миР-17-92) везује се за СТАТ3 промотор у хуманим макрофагима инфицираним токсоплазмом, регулише се и индукује анти -апоптоза као одговор на инфекцију Токопласма гондии 29 .Инфекција токсоплазмом повећава експресију миР-17-5п и миР-106б-5п, који су повезани са неколико хиперпролиферативних болести 30 .Ови подаци сугеришу да су миРНА домаћина регулисане инфекцијом Токопласма важни молекули за преживљавање паразита и патогенезу у биолошком понашању домаћина.
Измењене миРНА могу утицати на различите типове понашања током иницијације и прогресије малигних ћелија, укључујући глиоме: самодовољност сигнала раста, неосетљивост на сигнале који инхибирају раст, избегавање апоптозе, неограничени репликативни потенцијал, ангиогенезу, инвазију и метастазу и упалу.Код глиома, измењене миРНА су идентификоване у неколико студија профилисања експресије.
У овој студији, потврдили смо високе нивое експресије миРНА-21 у ћелијама домаћинима инфицираним токсоплазмом.миР-21 је идентификован као једна од најчешће прекомерно експримираних микроРНК у чврстим туморима, укључујући глиоме, 33 и његова експресија је у корелацији са степеном глиома.Нагомилани докази сугеришу да је миР-21 нови онкоген који делује као анти-апоптотички фактор у расту глиома и да је високо експримиран у ткивима и плазми малигнитета људског мозга.Занимљиво је да инактивација миР-21 у ћелијама и ткивима глиома изазива инхибицију пролиферације ћелија услед апоптозе зависне од каспазе.Биоинформатичка анализа предвиђених циљева миР-21 открила је вишеструке туморске супресорске гене повезане са путевима апоптозе, укључујући програмирану ћелијску смрт 4 (ПДЦД4), тропомиозин (ТПМ1), ПТЕН и кутију за главу О1 (ФокО1), са местом везивања миР-2121..22.38.
ФокО1, као један од фактора транскрипције (ФокО), је укључен у развој различитих типова хуманог карцинома и може регулисати експресију гена супресора тумора као што су п21, п27, Бим и ФасЛ40.ФокО1 може да веже и активира инхибиторе ћелијског циклуса као што је п27 да би сузбио раст ћелија.Штавише, ФокО1 је кључни ефектор ПИ3К/Акт сигнализације и регулише многе биолошке процесе као што су прогресија ћелијског циклуса и диференцијација ћелија кроз активацију транскрипције п2742.
У закључку, верујемо да егзосомални миР-21 добијен из микроглије инфициране токсоплазмом може играти важну улогу као регулатор раста ћелија глиома (слика 7).Међутим, потребне су даље студије како би се пронашла директна веза између егзосомалног миР-21, измењене инфекције токсоплазмом и раста глиома.Очекује се да ће ови резултати пружити полазну тачку за проучавање везе између инфекције токсоплазмом и инциденце глиома.
У овој студији је предложен шематски дијаграм механизма канцерогенезе глиома (мозга).Аутор црта у програму ПоверПоинт 2019 (Мицрософт, Редмонд, ВА).
Сви експериментални протоколи у овој студији, укључујући употребу животиња, били су у складу са Стандардним етичким смерницама за бригу о животињама и корисничком комитету Националног универзитета у Сеулу и одобрио их је Институционални одбор за ревизију Медицинског факултета Националног универзитета у Сеулу (ИРБ број СНУ- 150715).-2).Сви експериментални поступци су спроведени у складу са препорукама АРРИВЕ.
БВ2 мишја микроглија и У87 ћелије хуманог глиома су узгајане у Дулбеццо-овом модификованом орловом медијуму (ДМЕМ; Велгене, Сеул, Кореја) и медијуму Розвел Парк Меморијалног института (РПМИ; Велгене), респективно, од којих свака садржи 10% феталног говеђег серума, л-4 м глутамин, 0,2 мМ пеницилин и 0,05 мМ стрептомицин.Ћелије су култивисане у инкубатору са 5% ЦО2 на 37°Ц.Друга ћелијска линија глиома, У118, коришћена је за поређење са ћелијама У87.
Да би се изоловали егзозоми из сојева РХ и МЕ49 инфицираних Т. гондии, Т. гондии тахизоити (РХ сој) су сакупљени из трбушне дупље 6-недељних БАЛБ/ц мишева који су убризгани 3-4 дана пре.Тахизоити су испрани три пута са ПБС и пречишћени центрифугирањем у 40% Перцолл (Сигма-Алдрицх, Ст. Лоуис, МО, УСА)43.Да би се добили тахизоити соја МЕ49, БАЛБ/ц мишевима је интраперитонеално убризгано 20 ткивних циста, а трансформација тахизоита у цисте је прикупљена испирањем трбушне дупље 6-8 дана након инфекције (ПИ).Мишеви инфицирани ПБС-ом.МЕ49 тахизоити су узгајани у ћелијама са додатком 100 μг/мл пеницилина (Гибцо/БРЛ, Гранд Исланд, НИ, САД), 100 μг/мл стрептомицина (Гибцо/БРЛ) и 5% феталног говеђег серума (Лонза, Валкерсвилле, МД) .., САД) на 37 °Ц и 5% угљен-диоксида.Након култивације у Веро ћелијама, МЕ49 тахизоити су два пута пропуштени кроз иглу од 25, а затим кроз филтер од 5 µм да би се уклонили остаци и ћелије.Након испирања, тахизоити су ресуспендовани у ПБС44.Ткивне цисте соја Токопласма гондии МЕ49 одржаване су интраперитонеалном ињекцијом циста изолованих из мозга инфицираних Ц57БЛ/6 мишева (Ориент Био Анимал Центер, Сеонгнам, Кореја).Мозак мишева инфицираних МЕ49 је сакупљен након 3 месеца ПИ и млевен под микроскопом да би се изоловале цисте.Заражени мишеви су држани у посебним условима без патогена (СПФ) на Медицинском факултету Националног универзитета у Сеулу.
Укупна РНК је екстрахована из егзозома добијених од БВ2, БВ2 ћелија и ткива коришћењем миРНеаси Мини Кит (Киаген, Хилден, Немачка) према упутствима произвођача, укључујући време инкубације за корак елуирања.Концентрација РНК је одређена на спектрофотометру НаноДроп 2000.Квалитет РНК микромрежа је процењен коришћењем биоанализера Агилент 2100 (Агилент Тецхнологиес, ​​Амстелвеен, Холандија).
ДМЕМ са 10% ФБС сиромашним егзозомима је припремљен ултрацентрифугирањем на 100.000 г током 16 сати на 4°Ц и филтриран кроз филтер од 0,22 µм (Налгене, Роцхестер, НИ, УСА).БВ2 ћелије, 5 × 105, култивисане су у ДМЕМ-у који садржи 10% ФБС са осиромашеним егзозомима и 1% антибиотика на 37 ° Ц и 5% ЦО2.После 24 сата инкубације, ћелијама су додати тахизоити соја РХ или МЕ49 (МОИ = 10), а неинвазивни паразити су уклоњени у року од сат времена и поново напуњени ДМЕМ.Егзозоми из БВ2 ћелија су изоловани модификованим диференцијалним центрифугирањем, најшире коришћеном методом.Ресуспендујте пелет егзозома у 300 µл ПБС за анализу РНК или протеина.Концентрација изолованих егзосома је одређена коришћењем комплета за анализу БЦА протеина (Пиерце, Роцкфорд, ИЛ, УСА) и спектрофотометра НаноДроп 2000.
Преципитати из БВ2 ћелија или егзозоми изведени из БВ2 су лизирани у ПРО-ПРЕП™ раствору за екстракцију протеина (иНтРон Биотецхнологи, Сеонгнам, Кореја) и протеини су стављени на Цоомассие бриљантно плаво обојене 10% СДС полиакриламидне гелове.Поред тога, протеини су пребачени на ПВДФ мембране током 2 сата.Вестерн блотови су валидирани коришћењем Алик антитела (Целл Сигналинг Тецхнологи, Беверли, МА, САД) као егзосомалног маркера.ХРП-коњуговани козји анти-мишји ИгГ (Х + Л) (Бетхил Лабораториес, Монтгомери, ТКС, САД) и ЛАС-1000 плус луминесцентни анализатор слике (Фуји Пхотограпхиц Филм, Токио, Јапан) коришћени су као секундарно антитело..Урађена је трансмисиона електронска микроскопија ради проучавања величине и морфологије егзосома.Егзозоми изоловани из БВ2 ћелија (6,40 µг/µл) су припремљени на мрежицама обложеним угљеником и негативно обојени са 2% уранил ацетата током 1 мин.Припремљени узорци су посматрани на убрзавајућем напону од 80 кВ коришћењем ЈЕОЛ 1200-ЕКС ИИ (Токио, Јапан) опремљеног ЕС1000В Ерлангсхен ЦЦД камером (Гатан, Плеасантон, Калифорнија, САД).
Егзозоми добијени од БВ2 су обојени помоћу ПКХ26 Ред Флуоресцент Линкер Кит (Сигма-Алдрицх, Ст. Лоуис, МО, САД) током 15 минута на собној температури.Ћелије У87, 2 × 105, са егзозомима обележеним ПКХ26 (црвено) или без егзозома као негативном контролом, инкубиране су на 37 ° Ц током 24 сата у инкубатору са 5% ЦО2.У87 ћелијска језгра су обојена ДАПИ (плаво), ћелије У87 су фиксиране у 4% параформалдехиду 15 минута на 4 ° Ц, а затим анализиране у Леица ТЦС СП8 СТЕД ЦВ конфокалном микроскопском систему (Леица Мицросистемс, Маннхеим, Немачка).видљиво.
цДНК је синтетизована из сиРНА коришћењем Мир-Кс сиРНА синтезе првог ланца и СИБР кРТ-ПЦР комплета (Такара Био Инц., Схига, Јапан).Квантитативни ПЦР у реалном времену је изведен коришћењем иК5 ПЦР система за детекцију у реалном времену (Био-Рад, Херцулес, ЦА, УСА) коришћењем прајмера и шаблона помешаних са СИБР Премик-ом.ДНК је амплификована током 40 циклуса денатурације на 95°Ц током 15 с и жарења на 60°Ц током 60 с.Подаци из сваке ПЦР реакције су анализирани коришћењем модула за анализу података софтвера оптичког система иК™5 (Био-Рад).Релативне промене у експресији гена између одабраних циљних гена и β-актина/сиРНА (и У6) су израчунате коришћењем методе стандардне криве.Коришћене секвенце прајмера су приказане у табели 1.
3 к 104 У87 глиома ћелије су засејане у плоче са 96 јажица и помешане са егзозомима инфицираним токсоплазмом добијеним из БВ2 (50 μг/мЛ) или непулсним егзозомима изведеним из БВ2 (50 μг/мЛ) као контроле у ​​12, 18 сати .Брзина пролиферације ћелија одређена је коришћењем комплета за бројање ћелија-8 (Дојиндо, Кумамото, Јапан) (додатне слике С1-С3) 46 .
Женке БАЛБ/ц голих мишева старе 5 недеља купљене су од Ориент Био (Сеонгнам-си, Јужна Кореја) и држане појединачно у стерилним кавезима на собној температури (22 ± 2 ° Ц) и влажности (45 ± 15 ° Ц).%) на собној температури (22±2°Ц) и влажности (45±15%).12-часовни циклус светлости и 12-часовни тамни циклус изведени су под СПФ-ом (Центар за животиње на медицинском факултету у Сеулу).Мишеви су насумично подељени у три групе од по 5 мишева и свим групама је субкутано убризгано 400 мл ПБС-а који садржи 1 к 107 У87 ћелија глиома и смањен фактор раста БД Матригел™ (БД Сциенце, Мајами, ФЛ, САД).Шест дана након ињекције тумора, 200 мг егзозома изведених из БВ2 ћелија (са/без инфекције токсоплазмама) је убризгано на место тумора.Двадесет два дана након инфекције тумором, величина тумора мишева у свакој групи је мерена калипером три пута недељно, а запремина тумора је израчуната по формули: 0,5×(ширина)×2×дужина.
Анализа експресије микроРНА коришћењем миРЦУРИТМ ЛНА миРНА низа, 7. генерација има, мму и рно низове (ЕКСИКОН, Ведбаек, Данска) који покривају 1119 добро окарактерисаних мишева међу 3100 сонди за хватање миРНА људи, миша и пацова.Током ове процедуре, 250 до 1000 нг укупне РНК је уклоњено из 5′-фосфата третманом са алкалном фосфатазом у цревима телета, након чега је уследило обележавање са Хи3 зеленом флуоресцентном бојом.Обележени узорци су затим хибридизовани уметањем микромрежних плочица коришћењем комплета хибридне коморе (Агилент Тецхнологиес, ​​Санта Цлара, Калифорнија, САД) и комплета за хибридизацију дијапозитива (Агилент Тецхнологиес).Хибридизација је спроведена 16 сати на 56°Ц, а затим су микронизови испрани у складу са препорукама произвођача.Обрађени слајдови микромрежа су затим скенирани коришћењем Агилент Г2565ЦА система микрониз скенера (Агилент Тецхнологиес).Скениране слике су увезене коришћењем софтвера Агилент Феатуре Ектрацтион верзије 10.7.3.1 (Агилент Тецхнологиес) и интензитет флуоресценције сваке слике је квантификован коришћењем одговарајуће ГАЛ датотеке модификованог Екикон протокола.Подаци о микромрежу за тренутну студију депоновани су у ГЕО бази података под приступним бројем ГПЛ32397.
Профили експресије зрелих егзосомалних миРНА у микроглијама сојева РХ или МЕ49 инфицираних токсоплазмом анализирани су коришћењем различитих мрежних алата.миРНА повезане са развојем тумора идентификоване су коришћењем миРВалк2.0 (хттп://мирвалк.умм.уни-хеиделберг.де) и филтриране са нормализованим интензитетом сигнала (лог2) већим од 8,0.Међу миРНК, утврђено је да су различито експримиране миРНА више од 1,5 пута измењене анализом филтера миРНК измењених сојевима РХ или МЕ49 инфицираним Т. гондии.
Ћелије су засејане у плоче са шест бунарчића (3 к 105 ћелија/бунарићу) у опти-МЕМ (Гибцо, Царлсбад, Калифорнија, САД) коришћењем Липофецтамине 2000 (Инвитроген, Царлсбад, ЦА, УСА).Трансфектоване ћелије су култивисане 6 сати, а затим је медијум промењен у свеж комплетан медијум.Ћелије су сакупљене 24 сата након трансфекције.
Статистичка анализа је углавном вршена коришћењем Студентовог т-теста са Екцел софтвером (Мицрософт, Васхингтон, ДЦ, УСА).За експерименталну анализу на животињама, извршена је двосмерна АНОВА коришћењем софтвера Присм 3.0 (ГрапхПад Софтваре, Ла Јолла, Калифорнија, САД). П-вредности < 0,05 сматране су статистички значајним. П-вредности < 0,05 сматране су статистички значајним. Значениа П <0,05 считались статистически значајними. П вредности <0,05 сматране су статистички значајним. П 值< 0,05 被认为具有统计学意义。 П 值< 0,05 Значениа П <0,05 считались статистически значајними. П вредности <0,05 сматране су статистички значајним.
Све експерименталне протоколе коришћене у овој студији одобрио је Институционални одбор за ревизију Медицинског факултета Националног универзитета у Сеулу (ИРБ број СНУ-150715-2).
The data used in this study are available upon reasonable request from the first author (BK Jung; mulddang@snu.ac.kr). And the microarray data for the current study is deposited in the GEO database under registration number GPL32397.
Фурлеи, Ј. ет ал.Процењена глобална инциденција и морталитет од рака у 2018: ГЛОБОЦАН извори и методе.Интерпретација.Ј. Руцк 144, 1941–1953 (2019).
Расхеед, С., Рехман, К. & Акасх, МС Увид у факторе ризика тумора мозга и њихове терапијске интервенције. Расхеед, С., Рехман, К. & Акасх, МС Увид у факторе ризика тумора мозга и њихове терапијске интервенције.Расхид, С., Рехман, К. и Акасх, МС Преглед фактора ризика за туморе мозга и главне терапијске интервенције. Расхеед, С., Рехман, К. & Акасх, МС 深入了解脑肿瘤的危险因素及其治疗干预措施。 Расхеед, С., Рехман, К. & Акасх, МС Дубоко разумевање фактора ризика од тумора мозга и терапијских интервенција.Расхид, С., Рехман, К. и Акасх, МС Преглед фактора ризика за туморе мозга и главне терапијске интервенције.Биомедицинских наука.Фармацеут.143, 112119 (2021).
Като, И., Зханг, Ј. & Сун, Ј. Бактеријско-вирусне интеракције код карцинома ородигестивног и женског гениталног тракта код људи: сажетак епидемиолошких и лабораторијских доказа. Като, И., Зханг, Ј. & Сун, Ј. Бактеријско-вирусне интеракције код карцинома ородигестивног и женског гениталног тракта код људи: сажетак епидемиолошких и лабораторијских доказа.Като И., Зханг Ј. и Сун Ј. Бактеријско-вирусне интеракције у карциному људског гастроинтестиналног тракта и женског гениталног тракта: сажетак епидемиолошких и лабораторијских података. Като, И., Зханг, Ј. и Сун, Ј. Като, И., Зханг, Ј. & Сун, Ј. Бактериовирусна интеракција у варењу људске усне дупље и женском репродуктивном тракту: резиме науке о популарним болестима и лабораторијских доказа.Като И., Зханг Ј. и Сун Ј. Бактеријско-вирусне интеракције у хуманом гастроинтестиналном карциному и карциному женских гениталних органа: сажетак епидемиолошких и лабораторијских података.Рак 14, 425 (2022).
Магон, КЛ & Парисх, ЈЛ Од инфекције до рака: Како вируси ДНК тумора мењају централни метаболизам угљеника и липида ћелије домаћина. Магон, КЛ & Парисх, ЈЛ Од инфекције до рака: Како вируси ДНК тумора мењају централни метаболизам угљеника и липида ћелије домаћина.Махон, КЛ и Парисх, ЈЛ Инфекција од пожара до рака: како туморски вируси засновани на ДНК мењају централни метаболизам угљеника и липида ћелије домаћина. Магон, КЛ & Парисх, ЈЛ 从感染到癌症：ДНК 肿瘤病毒如何改变宿主细胞的中心碳和脂质代脂 Магон, КЛ & Парисх, ЈЛ Од инфекције до рака: како вируси ДНК тумора мењају централни метаболизам угљеника и липида ћелије домаћина.Махон, КЛ и Парисх, ЈЛ изазивају инфекцију на рак: како вируси ДНК тумора мењају централни метаболизам угљеника и липида у ћелијама домаћина.Отворена биологија.11, 210004 (2021).
Цорреиа да Цоста, ЈМ ет ал.Катехол естрогени шистозома и јетрених метиља и рака повезаних са хелминтима.фронт.вруће унутра.5, 444 (2014).