Гиардиа дуоденум је паразитски организам који изазива гиардију, цревну инфекцију посебно честу код мале деце са клиничким знацима дијареје.Раније смо известили да екстрацелуларни Г. дуоденалис покреће активацију нуклеотида који се везују за интрацелуларну олигомеризацију рецептора 3 (НЛРП3) и регулише инфламаторне одговоре домаћина кроз секрецију екстрацелуларних везикула (ЕВ).Међутим, тачни молекуларни обрасци дуоденококног ЕВ (ГЕВ) повезаног са патогеном који су укључени у овај процес и улога НЛРП3 инфламасома у гиардијази остаје да се разјасни.
Рекомбинантни еукариотски експресиони плазмиди пцДНА3.1(+)-алфа-2 и алфа-7.3 гиардини у ГЕВ су конструисани, трансфектовани у мишје примарне перитонеалне макрофаге и детектовани мерењем циљног молекула инфламације каспазе-1.Проверен је ниво експресије п20..Г. дуоденалис алфа-2 и алфа-7.3 гиардини су првобитно идентификовани мерењем НЛРП3 инфламазома (НЛРП3, про-интерлеукин-1 бета [ИЛ-1β], про-каспасе-1 и каспазе-1 п20), ИЛ секреције.Нивои 1β, нивои олигомеризације апоптотичног пегавог протеина (АСЦ) и имунофлуоресцентна локализација НЛРП3 и АСЦ.Улога НЛРП3 инфламасома у патогености Г. дуоденалис је затим процењена коришћењем мишева код којих је активација НЛРП3 била блокирана (НЛРП3 блокирани мишеви) и праћене су патолошке промене телесне тежине, дуоденално паразитско оптерећење и дуоденално ткиво.Поред тога, истражили смо да ли хиардини алфа-2 и алфа-7.3 ин виво ин виво индукују лучење ИЛ-1β преко НЛРП3 инфламасома и утврдили улогу ових молекула у патогености Г. дуоденалис код мишева.
Алфа-2 и алфа-7.3 гиардини индукује активацију НЛРП3 инфламасома ин витро.Ово је довело до активације п20 каспазе-1, повећања нивоа експресије НЛРП3, про-ИЛ-1β и про-капазе-1 протеина, значајног повећања секреције ИЛ-1β, формирања АСА мрља у цитоплазма, и индукција олигомеризације АСА.НЛРП3 запаљење Губитак пениса погоршава патогеност Г. дуоденалис код мишева.Мишеви третирани цистама гаважом од мишева блокираних НЛРП3 показали су повећан број трофозоита и тешка оштећења дуоденалних ресица, које су карактерисале некротичне крипте са скупљеним и гранањем.Експерименти ин виво су показали да гиардини алфа-2 и алфа-7.3 могу да индукују секрецију ИЛ-1β преко инфламасома НЛРП3, а имунизација гиардином алфа-2 и алфа-7.3 смањила је патогеност Г. дуоденалис код мишева.
Узети заједно, резултати ове студије сугеришу да гиардиа алпха-2 и алпха-7.3 изазивају појачану регулацију запаљења домаћина НЛРП3 и смањују инфективност Г. дуоденалис код мишева, који су обећавајући циљеви за превенцију гиардијазе.
Гиардиа дуоденум је екстрацелуларни протозојски паразит који живи у танком цреву и изазива 280 милиона случајева ђардијазе са дијарејом годишње, посебно међу малом децом у земљама у развоју [1].Људи се инфицирају питком водом или храном контаминираном цистама М. дуоденума, које затим улазе у стомак и излучују се желучаним соковима.Трофозоити Гиардиа дуоденума везују се за епител дуоденума, изазивајући мучнину, повраћање, дијареју, бол у стомаку и губитак тежине.Особе са имунодефицијенцијом и цистичном фиброзом су подложне инфекцији.До инфекције може доћи и оралним и аналним сексом [2].Лекови као што су метронидазол, тинидазол и нитазоксанид су пожељне опције лечења дуоденалних инфекција [3].Међутим, ови лекови за хемотерапију изазивају нежељене нежељене ефекте као што су мучнина, карциногенеза и генотоксичност [4].Стога је потребно развити ефикасније стратегије за спречавање инфекције Г. дуоденалис.
Инфламазоми су класа цитосолних протеинских комплекса који су део урођеног имунолошког одговора, помажући у одбрани од инвазије патогена и посредују у инфламаторним одговорима [5].Међу овим инфламазомима, инфламазом сличан нуклеотидима који везује нуклеотиде олигомеризације (НОД) рецептора 3 (НЛРП3) који везује нуклеотиде (НЛРП3) је опширно проучаван јер се може детектовати различитим обрасцима који су повезани са патогеном/молкуларним оштећењем (АМПП). ДАМП), препознаје, активира урођени имуни систем.и регулише хомеостазу црева код многих инфламаторних болести [6,7,8].Састоји се од рецептора за препознавање образаца (ПРР) НЛРП3, адаптерског апоптотичког споттед протеина (АСЦ) и ефекторске прокапазе-1 или прокапазе-11.НЛРП3 инфламазом делује као домаћин против инвазије патогена, као што је примећено у студијама Неоспора цанинум [9], Парацоццидиоидес брасилиенсис [10] и Леисхманиа.[11], али је такође пријављено да активација инфламасома НЛРП3 ограничава заштитне имуне одговоре и погоршава прогресију болести, на пример, код црва [12].На основу наших претходних налаза, известили смо да екстрацелуларни Г. дуоденалис покреће интрацелуларну активацију запаљења НЛРП3 и модулира инфламаторне одговоре домаћина секрецијом екстрацелуларних везикула (ЕВс) [13].Међутим, остаје да се утврди улога НЛРП3 инфламасома у инфекцији Г. дуоденалис ин виво.
Гиардини су првобитно описани као структурне компоненте цитоскелета Г. дуоденалис и играју важну улогу у покретљивости трофозоита и везивању епителних ћелија у танком цреву.Да би се боље прилагодили животној средини и повећали своју патогеност, трофозоити Г. дуоденалис развили су јединствену структуру цитоскелета која се састоји од 8 флагела, 1 средњег тела и 1 вентралног диска [14].Трофозоити Гиардиа дуоденума користе свој цитоскелет да продру у горњи део танког црева, посебно у дуоденум, и причврсте се за ентероците.Они стално мигрирају и везују се за епителне ћелије користећи ћелијски метаболизам.Стога постоји блиска веза између њиховог цитоскелета и вируленције.Гиардини специфични за Гиардиа дуоденум су компоненте структуре цитоскелета [15] и подељени су у четири класе: α-, β-, γ- и δ-гиардини.Постоји 21 члан породице α-гиардин, од којих сви имају способност зависне од калцијума да везују фосфолипиде [16].Они такође повезују цитоскелет са ћелијском мембраном.Код особа са дијарејом изазваном Г. дуоденалисом, α-гиардини су високо експримирани и имунореактивни током инфекције [17].Хетеролошке вакцине засноване на Гиардиа алфа-1 заштићене су од ђардијазе код мишева и потенцијални су антигени кандидати за развој вакцине [18].Алфа-8 гиардин, локализован у плазма мембрани и флагелама, али не и у вентралном диску, појачава покретљивост и брзину раста трофозоита код Г. дуоденалис [19].Алфа-14 гиардин се везује за структуре микротубула на флагелама и утиче на виталност Г. дуоденалис [20].Алфа-11 гиардин је присутан у изобиљу током животног циклуса, а прекомерна експресија алфа-11 гиардина оштећује сам Г. дуоденалис [21].Међутим, нејасно је да ли алфа-2 гиардин и алфа-7,3 гиардин штите од инфекције Г. дуоденалис и њихових основних механизама.
У овој студији, рекомбинантни еукариотски експресиони плазмиди пцДНА3.1(+)-алпха-2 гиардине и пцДНА3.1(+)-алпха-7.3 гиардине су трансфектовани у примарне перитонеалне макрофаге миша да би активирали НЛРП3 домаћина.Циљеви инфламасома су затим прегледани.Такође смо проценили улогу НЛРП3 инфламасома у патогености Г. дуоденалис, испитали да ли алфа-2 и алфа-7,3 гиардини индукују активацију НЛРП3 инфламасома ин виво и утврдили да ове две улоге гиардина у патогености Г. дуоденалис.Наш заједнички циљ је био да развијемо обећавајуће циљеве за превенцију инфекције Г. дуоденалис.
Дивљи тип (ВТ) Ц57БЛ/6 женке мишева старости 5–8 недеља купљене су од Лиаонинг Цхангсхенг експерименталног центра за животиње (Лиаонинг, Кина).Мишеви су имали слободан приступ води, добијали су стерилисану храну и држани су у циклусу светло/мрак од 12/12 сати.Пре инфекције, мишеви су примали антибиотике ад либитум у води за пиће са додатком ампицилина (1 мг/мЛ), ванкомицина (1 мг/мЛ) и неомицина (1,4 мг/мЛ) (сви купљени из Шангаја, Кина, вештачки организми) [22 ].].Мишеви који су изгубили способност да једу и пију више од 24 сата и изгубили ≥ 20% телесне тежине су хумано еутаназирани дислокацијом грлића материце.
Трофозоити ВБ Г. дуоденалис (Америцан Типе Цултуре Цоллецтион, Манассас, САД) су допуњени са 12,5% феталног говеђег серума (ФБС; Евери Греен, Зхејианг, Кина) и 0,1% говеђе жучи (Сигма-Алдрицх, Ст. Миссоури, САД ).САД) у микроаеробним условима.Конфлуентни трофозоити су сакупљени на леду и пасирани у односу 1:4 за даљу репродукцију.
Цисте Гиардиа дуоденума су индуковане као што је претходно описано [23], трофозоити су сакупљени у логаритамској фази, а затим разблажени медијумом који индукује инкапсулацију, пХ 7,1 (модификовани ТИИ-С-33) до коначне концентрације од 1 × 106 трофозоита/мЛ.концентрација жучи 0,05% медијум).Трофозоити су култивисани у анаеробним условима на 37°Ц до логаритамске фазе раста.Променити медијум у медијум за индукцију циста (пХ 7,8; ​​модификовани медијум ТИИ-С-33 са концентрацијом жучи 1%) и култивисати Г. дуоденалис на 37°Ц током 48–96 сати, током којих су формиране цисте посматране под микроскопом.Након што је већина трофозоита изазвана да формира цисте, мешавина културе је сакупљена и ресуспендована у стерилној дејонизованој води да би се лизирали преостали трофозоити.Цисте су избројане и ускладиштене на 4°Ц за накнадне анализе преко желудачне сонде код мишева.
Екстрацелуларне везикуле Гиардиа (ГЕВ) су обогаћене као што је претходно описано [13].Трофозоити у логаритамској фази раста су ресуспендовани у модификованом медијуму ТИИ-С-33 припремљеном са ФБС осиромашеним егзозомима (Биологицал Индустриес, Беит-Хаемек, Израел) до коначне концентрације од 1 × 106 паразита/мЛ и инкубирани 12 сати.изоловани су из супернатанта културе центрифугирањем на 2000 г током 10 мин, 10,000 г током 45 мин и 100,000 г током 60 мин.Преципитати су растворени у физиолошком раствору са фосфатним пуфером (ПБС), квантификовани коришћењем комплета за анализу БЦА протеина (Тхермо Фисхер Сциентифиц, Валтхам, МА, УСА) и чувани на -80°Ц или директно коришћени за даље анализе.
Примарни мишји перитонеални макрофаги припремљени су као што је претходно описано [24].Укратко, мишевима (старости од 6-8 недеља) је убризгано (интраперитонеално [ип]) 2,5 мл 2,98% Дифцо течног тиогликолног медијума (БД, Франклин Лакес, Њ, САД) и храњена су 3-4 непца.Суспензија макрофага је сакупљена из трбушне дупље мишева након еутаназије и центрифугирана 3 пута на 1000 г током 10 мин.Сакупљене ћелије су детектоване проточном цитометријом коришћењем ЦД11б маркера све док чистоћа ћелија није била >98%, а затим су додате у плоче са ћелијском културом са 6 отвора (4,5 к 106 ћелија/бунарићу) и инкубиране са 10% ФБС (Биоиндустри) на 37°Ц.и 5% ЦО2.
РНК је екстрахована из 1 × 107 трофозоита у 1 мл ТРИзол реагенса (Вазиме, Нањинг, Кина), геномска ДНК је екстрахована из укупне РНК Г. дуоденалис коришћењем МонСцрипт дсДНасе (Монад, Вухан, Кина) и синтетизована је комплементарна ДНК (цДНК). користећи МонСцрипт РТИИИИ Супер Мик (Монад) према упутствима произвођача.
Информације о ЦДС секвенци за циљни ген Г. дуоденалис добијене су од НЦБИ ГенБанк-а.Користите Пример 5.0 да дизајнирате специфичне прајмере за бешавно клонирање за сваки циљни ген.Предњи прајмер (5′-3′) се састоји од три дела: преклапајуће секвенце са линеаризованим вектором пцДНА3.1(+) ЕцоРВ (ТГГТГГААТТЦТГЦАГАТ) и стартних кодона АТГ и ГНН (ако прва база није Г).Ово се ради да би се побољшала ефикасност израза.Поред тога, најмање 16 бп комбинованих база (садржај ГЦ 40–60%/Тм приближно 55 °Ц).Реверзни прајмер (5′-3′) се састоји од два дела, преклапајуће секвенце са ЕцоРВ-линеаризованим вектором пцДНА3.1(+) (ГЦЦГЦЦАЦТГТГЦТГГАТ) и комбиноване базе од најмање 16 бп.(без последње две станице).базе) кодон као што је АА или ГА да би се омогућило рекомбинантним плазмидима да експримирају своје обележене протеине).Секвенце прајмера су наведене у табели 1 и синтетизовао их је Кангмет Биотецхнологи Цо., Лтд. (Цхангцхун, Кина).
Циљеви су амплификовани коришћењем Пфу ДНК полимеразе (Тианген, Пекинг, Кина) или Ек-так (Такара Биомедицал Тецхнологи [Беијинг] Цо., Лтд., Пекинг, Кина) коришћењем припремљене цДНК Г. дуоденалис као шаблона.Еукариотски експресиони векторски плазмид пцДНА3.1(+) линеаризован је рестрикцијским ензимом ЕцоРВ и дефосфорилисан коришћењем Фаст АП (Тхермо Фисхер Сциентифиц).Линеаризовани пцДНА3.1(+) фрагменти и амплификовани фрагменти циљног гена су пречишћени коришћењем комплета за пречишћавање ДНК гела (Тианген) и квантификовани коришћењем Нанодроп НД-2000 (Тхермо Фисхер Сциентифиц).Фрагмент пцДНА3.1(+) и сваки фрагмент циљног гена су рекомбиновани коришћењем МонЦлоне мешавине за једноструко клонирање (Монад Биотецх Цо., Лтд., Суџоу, Кина) и потврђени секвенцирањем ДНК коришћењем Цомате Биосциенце Цомпани Лимитед (Чангчун, Кина)..
Плазмиди без ендотоксина пцДНА3.1(+)-алпха-2 и пцДНА3.1(+)-алпха-7.3 су генерисани коришћењем СанПреп Мини комплета плазмида без ендотоксина (Сангон Биотецх).Концентрација је одржавана изнад 500 нг/µл да би се осигурало да ЕДТА у пуферу за елуирање не интерферира са тестом трансфекције.Примарни мишји перитонеални макрофаги су култивисани у плочама са 6 јажица са комплетним медијумом РПМИ 1640 (Биологицал Индустриес) током 12 сати, затим су ћелије испране 3 пута у топлом ПБС-у да би се уклонили пеницилин и стрептомицин, а затим у медијуму допуњеном комплетном медијумом.Плазмиди без ендотоксина пцДНА3.1(+)-алфа-2 и пцДНА3.1(+)-алпха-7.3 (2,5 μг) су разблажени у 125 μл Опти-МЕМ редукованог серумског медијума (Гибцо, Тхермо Фисхер Сциентифиц)..Затим је 5 µл Липофецтамине 2000 реагенса за трансфекцију (Инвитроген, Тхермо Фисхер Сциентифиц) разблажено у 125 µл Опти-МЕМ медијума са ниским серумом.Припремите комплексе липозом-ДНК мешањем разблаженог плазмида без ендотоксина са Липофецтамином 2000 и остављањем смеше да стоји на собној температури 5 минута.Пренесите комплексе одвојено у ћелије у сваком бунарчићу и полако мешајте.После 4 сата, медијум ћелијске културе је замењен са 2 мл комплетног медијума РПМИ 1640 и култура је настављена 24 сата.Свеж медијум ћелијске културе је додат ћелијама и инкубиран у различитим временским тачкама у зависности од дизајна теста.
Узорци протеина из супернатанта и ћелијских лизата су припремљени као што је претходно описано [25].Параметри мембранског трансфера за про-ИЛ-1β, про-капазу-1, каспазу-1 п20, НЛРП3, β-актин и Хис-таг били су 200 мА/90 мин.За интерлеукин 1β (ИЛ-1β; Р&Д Системс, Минеаполис, Минесота, САД), каспазу-1 (п20) (Адипоген, Швајцарска) и НЛРП3 (Адипоген СА, Епалингес, Швајцарска) и 1:5000 циљајући Хис таг ( Амилет Сциентифиц Вухан, Кина) и β-актин (Протеинтецх, Вухан, Кина).
Унакрсно повезивање са дисукцинимид субератом (ДСС) је изведено као што је претходно описано [26].Ћелије су испране 3 пута хладним ПБС и потпуно лизиране иглом од 27 у 50 µл АСЦ реакционог пуфера (пХ 8,0) који садржи 25 мМ На2ПО4, 187,5 мМ НаЦл, 25 мМ ХЕПЕС и 125 мМ НаХЦО3.Смеша је центрифугирана на 5000 г током 3 мин и пелета је зашивена са 10 ул ДСС (25 мМ у ДМСО) и 40 ул АСЦ реакционог пуфера током 30 мин на 37°Ц.Након центрифугирања на 5000 г током 10 минута, пелета је растворена у раствору од 40 µл АСЦ реакционог пуфера и 10 µл 6к пуфера за пуњење протеина (ТрансГен, Пекинг, Кина), а затим је раствор угашен на собној температури током 15 минута. мин., Затим кувајте 10 минута.Узорци протеина су затим подвргнути Вестерн блот-у коришћењем примарних анти-АСЦ антитела (Ванлеибио, Схенианг, Кина) у односу разблажења од 1:500.
Пратећи претходно описану процедуру [13], сакупљени су супернатанти ћелијске културе и одређена је секреција проинфламаторног цитокина ИЛ-1β коришћењем ИЛ-1 Бета ЕЛИСА комплета миша (Инвитроген, Тхермо Фисхер Сциентифиц).Претворите вредности ОД450нм у концентрације протеина користећи стандардну криву ИЛ-1β.
Ћелије обложене покровним стакалцима су нежно испране 3 пута у топлом ПБС-у, фиксиране у фиксатор ћелија ткива (Биосхарп, Пекинг, Кина) током 10 минута на собној температури (РТ), у 0,1% Тритон Кс-Пермеабилизе на 100 (разблажен у ПБС; Биосхарп ) током 20 минута на собној температури и блокирати у 5% албумину говеђег серума (у ПБС) током 2 сата на собној температури.Ћелије су затим инкубиране преко ноћи на 4°Ц са примарним антителима против АСЦ (разблажење 1:100) или НЛРП3 (разблаживање 1:100), респективно, и Ци3 обележеним козјим анти-зечјим ИгГ(Х+Л) (1:400; ЕартхОк , Сан Франциско, Калифорнија, САД) или ФИТЦ-коњуговани козји анти-мишји ИгГ (1:400; Еартхок) преко ноћи на 37°Ц у мраку 1 сат.Језгра су обојена Хоецхст 33258 (10 μг/мл; УЕ, Сузхоу, Кина) током 5 минута и посматрана под флуоресцентним микроскопом (Олимпус Цорпоратион, Токио, Јапан).
Мишеви су подељени у четири групе (н = 7 у свакој групи): (и) негативна контролна група третирана ПБС (само ПБС; давање 100 µл/мишју ПБС-а након чега следи дневна интраперитонеална ињекција 100 µл/миш ПБС 3 сата касније)., непрекидно 7 дана);(ии) негативна контролна група третирана инхибитором МЦЦ950 [27] (100 µл/мишу преко ПБС сонде, 3 сата касније, 10 мг/кг телесне тежине [БВ] МЦЦ950 [у ПБС] је даван интраперитонеално дневно, трајање 7 дана);(иии) Група инфекције цистом Г. дуоденалис (1,5 к 106 циста/мишу путем сонде, 3 сата касније, 100 μл/мишу ПБС интраперитонеално примењено дневно током 7 дана);(ив) Г. дуоденалис циста комбинована инфекција група за лечење МЦЦ950 инхибитором (1,5×106 циста/миш путем сонде, 10мг/кг телесне тежине МЦЦ950 интраперитонеално дневно током 7 дана у 3х).Телесна тежина сваког миша је праћена свакодневно и сви мишеви су еутаназирани 7. дана.Сакупљени дуоденум (дужине 3 цм) је исечен на мале комаде у 1 мл ПБС-а, цисте су уништене преко ноћи у ПБС-у на 4°Ц, а Г. дуоденалис трофозоити.Свеж дуоденум (дужине 1 цм) је изолован за бојење хематоксилином и еозином (Х&Е).
Мишеви су подељени у две групе: (и) МОЦК контролна група и (ии) група инхибитора МЦЦ950.Било је пет третмана у свакој групи (н = 7 по групи третмана): (и) негативна контролна група за третман ПБС (само ПБС; 100 µл/миш ПБС, интрамускуларна (ИМ) ињекција (тибиалис антериор) [28, 29] ;( ии) пцДНА3.1(+) плазмид негативна контролна група (100 µг/мишја ДНК, интрамускуларном ињекцијом (иии) позитивна контролна група за инфекцију цисте Г. дуоденалис (1,5 к 106 циста/миш, путем сонде) (ив) а); група третирана плазмидом пцДНА3.1(+)-алфа-2 (100 μг/мишја ДНК, интрамускуларном ињекцијом), и (в) група третирана плазмидом пцДНА3.1(+)-алфа-7.3 (100 μг/миш ДНК, након 12 сати проласка, мишеви у групи инхибитора МЦЦ950 добијали су дневну интраперитонеалну ињекцију МЦЦ950 (10 мг/кг телесне тежине) током 7 дана, док су мишеви у групи МОЦК примали једнаку количину ПБС третмана. Узорци крви су били сакупљени из очних јабучица мишева и остављени преко ноћи на 4 °Ц. Узорци серума су изоловани коришћењем ензимског имуносорбентног теста (ЕЛИСА) за и мерења нивоа ИЛ-1β.
Тридесет пет мишева је подељено у пет група (н=7/група).Група 1 је била негативна контролна група третирана ПБС: мишеви су примили 100 μл ПБС интрамускуларно и 3 дана касније путем сонде.Група 2 је позитивна контролна група инфицирана цистама Г. дуоденалис: мишевима је убризгано 100 μл ПБС-а, а 3 дана касније 1,5 к 106 циста/мишу је убризгано интрагастрично.Трећа група – имунизација плазмидом са пцДНА3.1(+) у комбинацији са контролном групом за инфекцију дуоденалне цисте: мишеви су примили 100 μг плазмидне ДНК пцДНА3.1(+)(им) орално, 1,5×106 циста/миш 3 за неколико дана.Групе 4 и 5 су биле рекомбинантни пцДНА3.1(+)-алфа-2 гиардински плазмид или пцДНА3.1(+)-алфа-7.3 гиардински плазмид у комбинацији са инфекцијом цисте Г. дуоденалис.Експериментална група: мишеви су примили 100 µг пцДНА3.1(+)-гиардин плазмидна ДНК (им), затим 3 дана касније, 1,5 × 106 циста по мишу је убризгано путем сонде.Телесна тежина сваког миша је праћена након увођења цисте Г. дуоденалис кроз цев.Свеж дуоденум је сакупљен за мерење паразитског оптерећења и анализу бојења ХЕ.
Хистопатолошке промене су анализиране према раније објављеној процедури [30].Свеж дуоденум је фиксиран фиксатором ћелија ткива, уграђен у парафин, исечен на делове од 4 μм, обојен Х&Е и анализиран под светлосним микроскопом.Репрезентативне патолошке промене у седам делова ткива код седам независних мишева је проценио патолог који није био свестан третмана и снимљене су при увећању од 200к.Дужина ресица и дубина крипта мерене су у складу са претходно описаним методама.
Резултати ин витро и ин виво су добијени у три примерка.Графикони су генерисани коришћењем ГрапхПад Присм 7.00 (ГрапхПад Софтваре Инц., Ла Јолла, ЦА, УСА).Разлике између две групе анализиране су т-тестом, док су разлике између ≥3 групе анализиране једносмерном анализом варијансе (АНОВА) коришћењем СПСС софтвера (верзија 22.0; СПСС ИБМ Цорп., Армонк, Њујорк, САД).Подаци су анализирани на хомогеност варијансе коришћењем Левеновог теста праћеног Бонферонијевим пост хоц тестом (Б).Значајност је изражена као П<0,05, П<0,01 и П<0,001 (није значајно [нс]) (П>0,05).
Наша претходна анализа ГЕВ протеомике у Кјото енциклопедији гена и генома (КЕГГ) показала је да многе мете могу бити укључене у активацију инфламаторних сигналних путева [13].Изабрали смо две обећавајуће мете, алфа-2 и алфа-7.3 гиардине, појачали смо ове молекуле и користили их за конструисање пцДНА3.1(+) еукариотског експресионог вектора.Након секвенцирања, рекомбинантни плазмиди експресије пцДНА3.1(+)-алфа-2 и алфа-7.3 гиардина су трансфектовани у примарне мишје перитонеалне макрофаге, а идентификован је протеин са потписом каспазе-1 п20 (фрагмент активиране каспазе-1). као разјашњавање кључних молекула који могу изазвати упалу.Резултати су показали да алфа-2 и алфа-7.3 гиардини могу индуковати експресију п20 каспазе-1 сличну ГЕВ.Није пронађен никакав ефекат на активацију каспазе-1 у нетретираној негативној контроли (само ПБС) и контроли плазмида пцДНА3.1(+) (Слика 1).
Мерење активације п20 каспазе-1 помоћу пцДНА3.1(+)-алфа-2 и алфа-7.3 гиардина.Рекомбинантни еукариотски експресиони плазмиди пцДНА3.1(+)-алфа-2 и алфа-7.3 гиардини (изнад сваке траке) су трансфектовани у примарне мишје перитонеалне макрофаге и супернатанти културе су сакупљени 24 сата касније.Вестерн блоттинг је коришћен за мерење нивоа експресије сигнатурног протеина каспазе-1 п20 инфламасома.Група за третман само са ПБС (трака Ц) и група за монотерапију пцДНА3.1(+) (станица пцДНА3.1) коришћене су као негативна контрола, а група за третман ГЕВ коришћена је као позитивна контрола.Експресија рекомбинантног протеина је потврђена детекцијом хистидинске ознаке у сваком протеину, а очекиване траке протеина су биле алфа-2 гиардин (38,2 кДа) и алфа-7,3 гиардин (37,2 кДа).ГЕВ, екстрацелуларни везикули Гиардиа дуоденум, пцДНА3.1(+), ЕцоРВ-линеаризовани вектор, СУП, супернатант
Да би се утврдило да ли алфа-2 гиардин и алфа-7.3 гиардин индукују експресију п20 каспазе-1 и играју улогу у активирању инфламаторног одговора домаћина НЛРП3, пцДНА3.1(+)-алпха-2 гиардин и пцДНА3.1(+)-алпха -7,3 гиардина је трансфектовано у примарне мишје перитонеалне макрофаге са рекомбинантном плазмидном ДНК, а одређени су нивои експресије, локализације и олигомеризације кључних инфламаторних протеина НЛРП3.У овом експерименту, ГЕВ је коришћен као позитивна контролна група, а група без третмана (само ПБС) или група која је третирана трансфекцијом пцДНА3.1(+) била је негативна група.Резултати су показали да је, као иу групи ГЕВ, рекомбинантна плазмидна ДНК гиардин пцДНА3.1(+)-алпха-2 и гиардин пцДНА3.1(+)-алпха-7.3 резултирала повећањем регулације НЛРП3, про-ИЛ-1β и активација прокапазе-1 и каспазе-1 (слика 2а).Поред тога, оба гиардина су изазвала значајно лучење ИЛ-1β (пцДНА3.1: АНОВА, Ф(4, 10) = 1,625, П = 0,1000; алфа-2 гиардин: АНОВА, Ф(4, 10) = 1,625, П = 0,0007 ).;алфа-7,3 гиардин: АНОВА, Ф(4, 10) = 1,625, П<0,0001;ГЕВ: АНОВА, Ф(4, 10) = 1,625, П = 0,0047) (Слика 2б).Већина АСЦ протеина је била мономерна у групи која није третирана или у групи која је третирана трансфицираном са пцДНА3.1(+) плазмидом, за разлику од пцДНА3.1(+)-алпха-2 или пцДНА3.1(+)-алпха- 7.3 гиардине.АСЦ олигомеризација се десила у рекомбинантној плазмидној ДНК ГЕВ позитивне контролне групе или групе, показујући олигомерни облик (Слика 2ц).Ови прелиминарни подаци сугеришу да алфа-2 гиардин и алфа-7,3 гиардин могу да изазову активацију запаљења НЛРП3.Накнадне имунофлуоресцентне студије о локализацији АСЦ и НЛРП3 показале су да је у негативној контролној групи АСЦ протеин био расут по цитоплазми и појавио се као тачкасти сигнал након стимулације пцДНА3.1(+)-алпха-2 са гиардином или пцДНА3.1(+)-алфа-7,3 гиардин група или ГЕВ позитивна контролна група (Слика 2д).У групама за негативну контролу и пцДНА 3.1 третиране плазмидом, сигнал протеина НЛРП3 није детектован, док флуоресцентна сигнална тачка као одговор на пцДНА3.1(+)-алфа-2 гиардин или пцДНА3.1(+)-алпха-7.3 је откривено..гиардине се налазе у цитоплазми или након стимулације ХЕВ (слика 2е).Ови подаци даље показују да Г. дуоденалис гиардин алпха-2 и гиардин алпха-7.3 активирају инфламазом НЛРП3 у примарним перитонеалним макрофагима миша.
пцДНА3.1(+)-алпха-2 гиардин и пцДНА3.1(+)-алпха-7.3 гиардин активирају инфламазом НЛРП3 у перитонеалним макрофагима миша.Трансфекција рекомбинантних еукариотских експресионих плазмида пцДНА3.1(+)-алпха-2 гиардин и пцДНА3.1(+)-алпха-7.3 гиардин у примарне мишје перитонеалне макрофаге и ћелије, или сакупите супернатант у року од 24 х за анализу експресије, олигомер , секреција.и локализација кључних инфламаторних протеина.Група са само ПБС (Ц) и група са појединачним третманом пцДНА3.1(+) коришћене су као негативна контрола, а група за третман ГЕВ коришћена је као позитивна група.а Кључни инфламаторни протеини НЛРП3, укључујући НЛРП3, про-ИЛ-1β, про-капазу-1 и п20 каспазу-1, откривени су Вестерн блот-ом.б Нивои секреције ИЛ-1β у супернатантима одређивани су коришћењем ензимског имуносорбентног теста (ЕЛИСА).Разлике између контролне и експерименталне групе анализиране су једносмерном анализом варијансе (АНОВА) коришћењем СПСС софтвера верзије 22.0.Звездице означавају значајне разлике између група **П<0,01 и ***П<0,001.ц Нивои АСЦ олигомеризације у пелетима одређени су ДСС анализом унакрсног повезивања, док су нивои АСЦ у ћелијским лизатима коришћени као контрола пуњења.д Визуелизација локализације ИСЦ применом имунофлуоресценције.Имунофлуоресценција је коришћена за визуелизацију локализације НЛРП3.АСЦ, апоптотички протеин сличан тачкици;ИЛ, интерлеукин;НЛРП3, рецептор сличан олигомеризацији који се везује за нуклеотиде 3;нс, није значајно (П > 0,05)
И Г. дуоденалис и ГЕВ-ови које лучи активирају инфламазом НЛРП3 и регулишу ин витро инфламаторне одговоре домаћина.Дакле, улога инфламасома НЛРП3 у патогености Г. дуоденалис остаје нејасна.Да бисмо истражили ово питање, дизајнирали смо експеримент између мишева инфицираних цистом Г. дуоденалис и мишева инфицираних цистом Г. дуоденалис + третманом инхибитором МЦЦ950 и упоредили експресију НЛРП3 инфламасома када су инфицирани цистом Г. дуоденалис.Детаљна шема експеримента је приказана на слици 3а.Промене у телесној тежини мишева у различитим третираним групама праћене су 7 дана након инфекције цистама, а резултати су приказани на Сл. 3б.У поређењу са групом третираном чистим ПБС, резултати су показали да (и) телесна тежина мишева инфицираних цистом Г. дуоденалис опада од 3. до 7. дана након инфекције;(ии) третман са МЦЦ950 инхибитором није имао значајан утицај на телесну тежину мишева..У поређењу са групом са једном инфекцијом, БВ групе са инфекцијом дуоденума третиране са МЦЦ950 смањио се у различитим степенима (дан 1: АНОВА, Ф(3, 24) = 1,885, П = 0,0148; дан 2: АНОВА, Ф( 3, 24) ) = 0,4602, П<0,0001: АНОВА, Ф(3, 24) = 0,8360, П = 0,0010: АНОВА, Ф(3, 24) = 1,683, П = 0,0052; (3, 24)=0,6497, П=0,0645: АНОВА, Ф(3, 24)=5,457, П=0,0175: АНОВА, Ф(3, 24) = 2,893, П=0,0202;Ови подаци показују да НЛРП3 инфламазом штити мишеве од значајног губитка тежине у раним фазама (2-4 дана) дуоденалне инфекције.Затим смо имали за циљ да откријемо трофозоите Г. дуоденалис у течности за испирање дуоденума и резултати су приказани на слици 3ц.У поређењу са групом инфекције цистом Г. дуоденалис, број трофозоита у дуоденуму се значајно повећао након блокирања инфламасома НЛРП3 (т(12) = 2,902, П = 0,0133).Ткива дванаестопалачног црева обојена ХЕ су показала, у поређењу са негативном контролом третираном само са ПБС и МЦЦ950: (и) Инфекција цисте Г. дуоденалис је довела до оштећења дуоденалних ресица (АНОВА, Ф(3, 24)=0,4903, П= 0,0488 ) и атрофија крипте (АНОВА, Ф(3, 24) = 0,4716, П = 0,0089);(ии) дуоденум од мишева инфицираних цистама Г. дуоденалис и третираних инхибиторима МЦЦ950.ресице дуоденума су оштећене и мртве (АНОВА, Ф(3, 24) = 0,4903, П = 0,0144) са атрофијом и гранањем крипте (АНОВА, Ф(3, 24) = 0,4716, П = 0, 0481) (Сл. 3д- ф) .Ови резултати сугеришу да инфламазом НЛРП3 игра улогу у смањењу патогености Г. дуоденалис.
Улога НЛРП3 инфламасома у инфекцији Гиардиа дуоденума.Мишеви су давани (ив) са дуоденококним цистама и затим третирани са или без МЦЦ950 (ип).Групе са појединачним третманом са ПБС или МЦЦ950 су коришћене као контроле.Експериментална група и режим лечења.б Телесна тежина мишева у свакој од различитих група за третман је праћена током 7 дана.Разлика између групе за инфекцију Г. дуоденалис и групе за лечење инфекције Г. дуоденалис + МЦЦ950 анализирана је т-тестом коришћењем СПСС софтвера верзије 22.0.Звездице означавају значајне разлике при *П<0,05, **П<0,01 или ***П<0,001.ц Оптерећење паразитима је одређено бројањем трофозоита у течности за испирање дуоденума.Разлика између групе за инфекцију Г. дуоденалис и групе за лечење инфекције Г. дуоденалис + МЦЦ950 анализирана је т-тестом коришћењем СПСС софтвера верзије 22.0.Звездице означавају значајне разлике при *П < 0,05.д Резултати дуоденалне хистопатологије бојења хематоксилином и еозином (Х&Е).Црвене стрелице означавају оштећење ресица, зелене стрелице означавају оштећење крипта.Скала бар: 100 µм.е, ф Статистичка анализа висине ресица дуоденума и висине крипте миша.Звездице означавају значајне разлике при *П<0,05 и **П<0,01.Резултати су узети из 7 независних биолошких експеримената.БВ, телесна тежина;иг, интрагастрични пут испоруке;ип, интраперитонеални пут испоруке;нс, није значајно (П > 0,05);ПБС, физиолошки раствор пуферован фосфатом;ВТ, дивљи тип
Лучење ИЛ-1β је обележје активације упале.Да бисмо утврдили да ли Г. дуоденалис алфа-2 гиардин и алфа-7.3 гиардин активирају инфламазом домаћина НЛРП3 ин виво, користили смо нетретиране ВТ мишеве (лажна група) и мишеве блокиране НЛРП3 инфламазомима (МЦЦ950 инхибирана група за лечење).Детаљна шема експеримента је приказана на слици 4а.Експерименталне групе су се састојале од мишева третираних ПБС-ом, третманом цисте Г. дуоденалис гаважом, интрамускуларном ињекцијом пцДНА3.1 и интрамускуларном ињекцијом пцДНА3.1(+)-алфа-2 гиардина или пцДНА3.1-алфа-7.3 гиардина.Седмог дана након интрамускуларне примене рекомбинантног плазмида, сакупљен је серум и одређен је ниво ИЛ-1β у свакој групи.Као што је приказано на слици 4б, у МОЦК групи: (и) у поређењу са групом ПБС, третман пцДНА3.1 није имао значајан утицај на секрецију ИЛ-1β (АНОВА, Ф(4.29)=4.062, П=0.9998), међутим, Секреција ИЛ-β је била значајно повишена у групи циста Г. дуоденалис (АНОВА, Ф(4, 29) = 4,062, П = 0,0002), (ии) пцДНА3.1-алфа-2 гиардин и пцДНА3.1- Интрамускуларна ињекција алфа-7,3 гиардина значајно је повећала нивое ИЛ-1β у серуму (АНОВА, Ф(4, 29) = 4,062, П<0,0001);(иии) пцДНА3.1-алфа-7,3 гиардин је индуковао високе нивое секреције ИЛ-1β у групи за интрамускуларну ињекцију пцДНА3.1-алфа-2 гиардина (АНОВА, Ф(4, 29) = 4,062, П = 0,0333) .У поређењу са сваком групом у групи за третман МЦЦ950 и групи МОЦК: (и) нивои секреције ИЛ-1β у ПБС контролној групи и пцДНА3.1 контролној групи су се смањили до одређене мере након блокирања инхибитора МЦЦ950, али разлика није била значајно (ПБС: АНОВА, Ф (9, 58) = 3,540, П = 0,4912 пцДНА3.1: АНОВА, Ф(9, 58) = 3,540, П = 0,5949);(ии) након блокирања МЦЦ950., лучење ИЛ-1β је значајно смањено у групи инфицираној цистом Г. дуоденалис, групи пцДНА3.1-алфа-2 гиардина и пцДНА3.1-алфа-7.3 групи гиардина (Г. дуоденалис: АНОВА, Ф(9 , 58) = 3.540, П = 0.0120 пцДНА3.1-алпха-2 гиардине: АНОВА, Ф(9, 58) = 3.540, П = 0.0447 пцДНА3.1-алпха-7.3 гиардине (9, АНОВА5; ) = 3,540, П = 0,0164).Ови резултати сугеришу да алфа-2 гиардин и алфа-7,3 гиардин посредују у активацији НЛРП3 инфламасома ин виво.
пцДНА3.1(+)-гиардини ин виво активирају ин виво домаћина НЛРП3.Мишеви су имунизовани (ИМ) са рекомбинантним еукариотским експресионим плазмидом пцДНА3.1(+)-алпха-2 гиардином или пцДНА3.1(+)-алпха-7.3 гиардином и затим третирани са МЦЦ950 (ип; МЦЦ950 група) или не (лажна група ).Група за третман ПБС или пцДНА3.1(+) плазмидом је коришћена као негативна контрола, група за третман цисте Г. дуоденалис је коришћена као позитивна контрола.Експериментална група и режим лечења.б Нивои ИЛ-1β у серуму код мишева су мерени 7. дана ЕЛИСА тестом.Разлике између група у МОЦК групи су анализиране коришћењем једносмерне АНОВА, а разлике између МОЦК групе и МЦЦ950 групе су анализиране коришћењем т-теста софтвера СПСС верзије 22.0.Звездице указују на значајне разлике између третираних група у МОЦК групи, *П<0,05 и ***П<0,001;знаци долара ($) указују на значајне разлике између сваке групе у МОЦК групи и МЦЦ950 групе на П<0,05.Резултати седам независних биолошких експеримената.и, интрамускуларна ињекција, нс, није значајно (П > 0,05)
Да бисмо истражили ефекат алфа-2 и алфа-7,3 гиардином посредоване активације инфламазома домаћина НЛРП3 на инфективност Г. дуоденалис, користили смо ВТ Ц57БЛ/6 мишеве и убризгали алфа-2 гиардин и алфа-7,3 гиардин.плазмид је убризган интрамускуларно, након 3 дана кроз желудачну цев цисте Г. дуоденалис, након чега су мишеви посматрани 7 дана.Детаљна шема експеримента је приказана на слици 5а.Свакодневно је мерена телесна тежина сваког миша, узорци свежег дуоденалног ткива су сакупљани 7. дана након примене кроз гастричну сонду, мерен је број трофозоита и уочене су хистопатолошке промене.Као што је приказано на слици 5б, са повећањем времена храњења, БВ мишева у свакој групи постепено се повећавао.МТ мишева је почео да се смањује 3. дана након интрагастричне примене цисте Г. дуоденалис, а затим се постепено повећавао.Активација инфламасома НЛРП3 индукованог интрамускуларном ињекцијом алфа-2 гиардина и алфа7.3 гиардина значајно је ослабила губитак тежине код мишева (1. дан: пцДНА3.1-алфа-2 гиардин, АНОВА, Ф(4, 30) = 1,399 = 0,9754 Дан 1: пцДНА3.1-алпха-7,3 гиардин, АНОВА, Ф(4, 30)=1,399, П=0,9987 Дан 2: пцДНА3.1-алпха-2 гиардин, АНОВА, Ф( 4, 30) = 0,3172, П = 0,9979 Дан 2: пцДНА3,1-алфа-7,3 гиардине, АНОВА, Ф(4, 30) = 0,3172, П = 0,8409 : пцДНА3,1-алпха-2 гиардине 4, 30) = 0,8222, П = 0,0262 Дан 3: пцДНА3.1-алпха-7,3 гиардине, АНОВА, Ф(4, 30) = 0,8222, П = 0,0083 Дан 4: пцДНА3.1-алпха-АН; , Ф(4, 30) = 0,5620, П = 0,0012, 4. дан: пцДНА3.1-алпха-7.3 гиардине, АНОВА, Ф(4, 30) = 0,5620, П < 0,0001, 5. дан: пцДНА3.1-алпха 2 гиардине, АНОВА, Ф(4, 30) = 0,9728, П < 0,0001 Дан 5: пцДНА3.1-алпха -7,3 гиардине, АНОВА, Ф(4, 30) = 0,9728, П < 0,0001 3. дан: 1 ком - ДНА алфа-2 гиардин, АНОВА, Ф(4, 30) = 0,7154, П = 0,0012, дан 6: пцДНА3.1-алфа-7,3 гиардин, АНОВА, Ф(4, 30) = 0,7154, П = 0,0006;Дан 7: пцДНА3.1-алпха-2 гиардин, АНОВА, Ф(4, 30) = 0,5369, П<0,0001 Дан 7: пцДНА3.1-алпха-7,3 гиардин, АНОВА, Ф(4, 30) = 0,5369, П <0,0001).Паразитско оптерећење је процењено у дуоденуму (слика 5ц).У поређењу са нетретираном позитивном контролом и групом којој је убризган празан вектор пцДНА3.1, број трофозоита Г. дуоденалис је значајно смањен у групама којима су убризгани α-2 гиардин и α-7,3 гиардин (пцДНА3.1-алпха -2 гиардин: АНОВА, Ф(3, 24) = 1,209, П = 0,0002, пцДНА3.1-алфа-7,3 гиардин: АНОВА, Ф(3, 24) = 1,209, П<0,0001).Поред тога, гиардин алфа-7,3 је био заштитнији код мишева него гиардин алфа-2 (АНОВА, Ф(3, 24) = 1,209, П = 0,0081).Резултати ХЕ бојења су приказани на сл.5д–ф.Мишеви којима је убризган алфа-2 гиардин и алфа-7,3 гиардин имали су мање лезија дуоденалног ткива, манифестованих оштећењем ресица, у поређењу са мишевима којима је убризган Г. дуоденалис и мишевима којима је убризган Г. дуоденалис у комбинацији са празним пцДНА3 вектором .1 Зоом.(пцДНА3.1-алпха-2 гиардин: АНОВА, Ф(3, 24) = 2.466, П = 0.0035 или П = 0.0068; пцДНА3.1-алпха-7.3 гиардин: АНОВА, Ф(3, 24) = 2.466, П = 0,0028 или П = 0,0055) и смањена атрофија крипте (пцДНА3.1-алпха-2 гиардин: АНОВА, Ф(3, 24) = 1,470, П = 0,0264 или П = 0,0158; пцДНА3.1-алпха-2 гиардине: АНОВА , Ф(3, 24) = 1,470, П = 0,0371 или П = 0,0191).Ови резултати сугеришу да алфа-2 гиардин и алфа-7,3 гиардин смањују инфективност Г. дуоденалис активацијом НЛРП3 инфламасома ин виво.
Улога пцДНА3.1(+)-гиардина у инфекцији Г. дуоденалис.Мишеви су имунизовани (ИМ) са рекомбинантним еукариотским експресионим плазмидима пцДНА3.1(+)-алфа-2 гиардином или пцДНА3.1(+)-алфа-7.3 гиардином, а затим изазвани цистама Г. дуоденалис (иг).ПБС група и група за лечење цисте дуоденума пцДНА3.1(+) + коришћена је као негативна контролна група, а група за лечење цисте дуоденума је коришћена као позитивна контролна група.Експериментална група и режим лечења.б МТ мишева у свакој од различитих група третмана је праћен 7 дана након изазивања.Звездице указују на значајне разлике између група у групи Г. дуоденалис и групи пцДНА3.1(+)-алфа-2 гиардина, *П < 0,05, **П < 0,01 и ***П < 0,001;знак долара ($) указује на значајну разлику између сваке групе Г. дуоденалис и пцДНА3.1(+)-алпха-7.3 јардин групе, $$П<0.01 и $$$П<0.001.ц Оптерећење паразитима је одређено пребројавањем броја трофозоита у 1 мл дуоденалног испирања из дуоденума (дужине 3 цм) и изражено као број паразита по цм дуоденума.Разлике између групе заражене Г. дуоденалис, групе пцДНА3.1(+)-алфа-2 гиардина и групе пцДНА3.1(+)-алпха-7.3 гиардина анализиране су једносмерном АНОВА-ом коришћењем СПСС софтвера верзије 22.0.Звездице означавају значајне разлике при **П<0,01 и ***П<0,001.д Хистопатолошке промене у дуоденуму.Црвене стрелице означавају оштећење ресица, зелене стрелице означавају оштећење крипта.Скала бар: 100 µм.е, ф Статистичка анализа висине ресица дуоденума миша (е) и висине крипте (ф).Разлике између група на слици 1д анализиране су једносмерном АНОВА-ом коришћењем СПСС софтвера верзије 22.0.Звездице означавају значајне разлике при *П<0,05 и **П<0,01.Резултати седам независних биолошких експеримената.нс, није значајно (П > 0,05)
Гиардиа дуоденум је добро познати цревни паразит људи и других сисара који изазива гиардију.Године 2004. укључен је у Иницијативу СЗО за запостављене болести због високе преваленције током 6 година, посебно у заједницама ниског социоекономског статуса [32].Урођени имуни систем игра кључну улогу у имунолошком одговору на инфекцију Г. дуоденалис.Пријављено је да мишји макрофаги гутају и убијају Г. дуоденалис ослобађањем екстрацелуларних замки [33].Наше претходне студије су показале да Г. дуоденалис, неинвазивни екстрацелуларни паразит, активира п38 МАПК, ЕРК, НФ-κБ п65 и НЛРП3 инфламаторне сигналне путеве у макрофагима миша да регулише инфламаторне одговоре домаћина, а ослобођени ГЕВ може побољшати овај процес.13], 24].Међутим, тачни ПАМП-ови укључени у упалу регулисану НЛРП3 инфламазомима у ГЕВ-у и улога НЛРП3 инфламасома у гиардијази остаје да се разјасни.Да бисмо расветлили ова два питања, спровели смо ову студију.
НЛРП3 инфламазом се налази у цитоплазми имуних ћелија и може се активирати разним честицама као што су кристали мокраћне киселине, токсини, бактерије, вируси и паразити.У бактеријским студијама, токсини су идентификовани као кључни ПАМП-ови који активирају инфламаторне сензоре, што доводи до упале и смрти ћелије [34].Неки структурно различити токсини, као што су хемолизин из Стапхилоцоццус ауреус [35] и Есцхерицхиа цоли [36], хемолизин БЛ (ХБЛ) из ентеротоксина (НХЕ) [37], индукују активацију НЛРП3 инфламације.Студије вируса су показале да су протеини вируленције као што су САРС-ЦОВ-2 протеин омотача (Е) [38] и НС5 протеин Зика вируса [39] важни ПАМП-ови које препознаје НЛРП3 рецептор.У студијама о паразитима, пријављено је да су многи паразити повезани са активацијом инфламасома домаћина, као што су Токопласма гондии, Трицхомонас вагиналис [40], Трипаносома црузи [41] и Леисхманиа [42].Протеини густих гранула ГРА35, ГРА42 и ГРА43, повезани са вируленцијом Токопласма гондии, потребни су за индукцију пироптозе у макрофагима Левис пацова [43].Поред тога, неке студије Лешманије су се фокусирале на појединачне молекуле укључене у инфламазом НЛРП3, као што је липофосфогликан мембране паразита [44] или цинк металопротеаза [45].Међу алфа-гиардин породицом гена сличних анексину, показало се да је алфа-1 гиардин потенцијални кандидат за вакцину који пружа заштиту од Г. дуоденалис на мишјем моделу [18].У нашој студији, одабрали смо факторе вируленције Г. дуоденалис алфа-2 и алфа-7,3 гиардине, који су јединствени за гиардију, али су релативно мање пријављени.Ова два циљна гена су клонирана у вектор пцДНА3.1(+) еукариотског система експресије ради анализе активације упале.
У нашем моделу миша, цепани фрагменти каспазе служе као маркери инфламаторне активације.Након стимулације, НЛРП3 ступа у интеракцију са АСЦ, регрутује прокаспазе и генерише активне каспазе које цепају про-ИЛ-1β и про-ИЛ-18 у зреле ИЛ-1β и ИЛ-18, респективно -18.Инфламаторне каспазе (капазе-1, -4, -5 и -11) су очувана породица цистеинских протеаза које су критичне за урођену одбрану и укључене су у упалу и програмирану ћелијску смрт [46].Каспаза-1 се активира канонским инфламазомима [47], док се каспазе-4, -5 и -11 цепају током формирања атипичних инфламазома [48].У овој студији, користили смо перитонеалне макрофаге миша као модел и истраживали каспазу-1 п20 каспазу-1 као маркер активације инфламације домаћина НЛРП3 у студијама инфекције Г. дуоденалис.Резултати су показали да су многи алфа-гиардини одговорни за типичну активацију упале, што је у складу са открићем кључних молекула вируленције укључених у бактерије и вирусе.Међутим, наша студија је само прелиминарни преглед и постоје и други молекули који могу да активирају некласичне инфламасоме, јер је наша претходна студија открила и класичне и некласичне инфламасоме у инфекцији Г. дуоденалис [13].Да бисмо даље утврдили да ли је генерисана п20 каспаза-1 повезана са инфламазомом НЛРП3, трансфицирали смо алфа-2 и алфа-7.3 гиардине у перитонеалне макрофаге миша да бисмо одредили нивое експресије кључних молекулских протеина и нивое олигомеризације АСЦ, потврђујући да се оба α-гиардина активирају инфламазом НЛРП3.Наши резултати се мало разликују од оних Манко-Прикхода ет ал., који су известили да стимулација Цацо-2 ћелија само сојевима Г. мурис или Е. цоли ЕПЕЦ може повећати интензитет флуоресценције НЛРП3, АСЦ и каспазе-1, иако не значајно, док је костимулација Г. мурис и Е. цоли повећала нивое три протеина [49].Ово неслагање може бити последица разлика у избору врста Гиардиа, ћелијских линија и примарних ћелија.Такође смо извршили ин виво тестове користећи МЦЦ950 на 5-недељним женкама мишева ВТ Ц57БЛ/6, који су подложнији Г. дуоденалис.МЦЦ950 је моћан и селективан инхибитор НЛРП3 малих молекула који блокира канонску и неканонску активацију НЛРП3 у наномоларним концентрацијама.МЦЦ950 инхибира активацију НЛРП3, али не утиче на активацију АИМ2, НЛРЦ4 и НЛРП1 инфламаторних путева или ТЛР сигналних путева [27].МЦЦ950 блокира активацију НЛРП3, али не инхибира покретање НЛРП3, ефлукс К+, прилив Ца2+ или интеракцију између НЛРП3 и АСЦ;уместо тога, он инхибира активацију инфламасома НЛРП3 блокирањем АСЦ олигомеризације [27].Због тога смо користили МЦЦ950 у ин виво студији да бисмо одредили улогу инфламасома НЛРП3 након ињекције гиардина.Активирана каспаза-1 п10 цепа проинфламаторне цитокине про-ИЛ-1β и про-ИЛ-18 у зреле ИЛ-1β и ИЛ-18 [50].У овој студији, нивои ИЛ-1β у серуму код мишева третираних гиардином са или без МЦЦ950 коришћени су као индикатор да ли је НЛРП3 инфламазом активиран.Као што се очекивало, третман МЦЦ950 је значајно смањио нивое ИЛ-1β у серуму.Ови подаци јасно показују да су Г. дуоденалис гиардин алфа-2 и гиардин алфа-7.3 у стању да активирају инфламазом миша НЛРП3.
Значајни подаци прикупљени током протекле деценије показали су да је ИЛ-17А главни регулатор имунитета против Г. мурис, који индукује ИЛ-17РА сигнализацију, производи антимикробне пептиде и регулише активацију комплемента [51].Међутим, инфекција Гиардиа се чешће јавља код младих одраслих особа, а пријављено је да инфекција Гиардиа код младих мишева не активира одговор ИЛ-17А да би показао свој заштитни ефекат [52], што је подстакло истраживаче да потраже друге имуномодулаторне Гиардиа.механизми инфекције хелминтима.Аутори недавне студије су известили да Г. мурис може активирати инфламазом НЛРП3 од стране Е. цоли ЕПЕЦ, који промовише производњу антимикробних пептида и смањује његов капацитет везивања и број трофозоита у цревном тракту, чиме се смањује озбиљност дебелог црева. болести изазване бацилима [49].НЛРП3 инфламазом је укључен у развој различитих болести.Истраживања су показала да Псеудомонас аеругиноса покреће аутофагију у макрофагима како би се избегла ћелијска смрт, а овај процес зависи од активације инфламасома НЛРП3 [53].За Н. цанинум, активација инфламасома НЛРП3 посредована реактивним врстама кисеоника ограничава његову репликацију у домаћину, чинећи га потенцијалном терапијском метом [9].Утврђено је да парацоццидиоидес брасилиенсис индукује активацију инфламасома НЛРП3 у дендритским ћелијама добијеним из коштане сржи миша, што резултира ослобађањем инфламаторног цитокина ИЛ-1β, који игра кључну улогу у одбрани домаћина [10].Неколико врста Леисхманиа, укључујући Л. амазоненсис, Л. мајор, Л. бразилиенсис и Л. инфантум цхагаси, активирају НЛРП3 и АСЦ зависну каспазу-1 у макрофагима, као и инфекцију Леисхманиа.Репликација паразита је појачана код мишева са недостатком гена НЛРП3/АСЦ/цаспасе-1 [11].Замбони и др.Пријављено је да инфекција лајшманијом изазива активацију инфламасома НЛРП3 у макрофагима, што ограничава интрацелуларну репликацију паразита.Дакле, Леисхманиа може инхибирати активацију НЛРП3 као стратегију избегавања.У ин виво студијама, инфламазом НЛРП3 је допринео елиминацији Лајшманије, али није утицао на ткива [54].Насупрот томе, у студијама хелминтијазе, активација инфламасома НЛРП3 потиснула је заштитни имунитет домаћина против гастроинтестиналне хелминтијазе [12].Шигела је једна од главних бактерија које изазивају дијареју широм света.Ове бактерије могу да индукују производњу ИЛ-1β преко П2Кс7 рецептора посредованог изливом К+, реактивним врстама кисеоника, лизозомском киселином и оштећењем митохондрија.НЛРП3 инфламазом негативно регулише фагоцитозу и бактерицидну активност макрофага против шигела [55].Студије плазмодијума су показале да мишеви са недостатком АИМ2, НЛРП3 или каспазе-1 инфицирани плазмодијумом производе високе нивое интерферона типа 1 и отпорнији су на инфекцију плазмодијумом [56].Међутим, улога алфа-2 гиардина и алфа-7.3 гиардина у изазивању патогене активације запаљења НЛРП3 код мишева је нејасна.
У овој студији, инхибиција инфламасома НЛРП3 од стране МЦЦ950 смањила је БВ и повећала број трофозоита у течности за испирање црева код мишева, што је резултирало озбиљнијим патолошким променама у дуоденалном ткиву.Алфа-2 гиардин и алфа-7.3 гиардин активирају НЛРП3 инфламазом миша домаћина, повећавају телесну тежину миша, смањују број трофозоита у течности за испирање црева и ублажавају патолошке лезије дуоденума.Ови резултати сугеришу да Г. дуоденалис може да активира инфламазом домаћина НЛРП3 преко алфа-2 гиардина и алфа-7,3 гиардина, смањујући патогеност Г. дуоденалис код мишева.
Наши резултати заједно показују да алфа-2 и алфа-7.3 гиардини индукују активацију инфламазома домаћина НЛРП3 и смањују инфективност Г. дуоденалис код мишева.Стога су ови молекули обећавајуће мете за превенцију ђардијазе.
       Data supporting the results of this study can be obtained from the respective author at gongpt@jlu.edu.cn.
Лианг АКС, Лианг ААМ, Хуанг АХЦ, Серги КМ, Кам ЈКМ.Гиардиасис: преглед.Недавно је откривено да је Пат Инфлам алергичан на лекове.2019;13:134–43.
Есцобедо АА, Тсимерман С. Гиардиасис: преглед фармакотерапије.Стручно мишљење фармацеута.2007;8: 1885–902.
Тиан Хуафенг, Цхен Бин, Вен Јианфенг.Гиардиасис, отпорност на лекове и откривање нових циљева.Инфецтс Дисорд мете дрога.2010;10:295–302.
Ванг З, Зханг Кс, Ксиао Ии, Зханг В, Ву Кс, Кин Т, итд. НЛРП3 инфламаторне и инфламаторне болести.Окиде Мед Целл Лонгев.2020;2020:4063562.
Цхен ГИ, Нунез Г. Улога инфламасома у интестиналној инфламацији и раку.Гастроентерологија.2011;141:1986–99.
Пеллегрини Ц, Антониоли Л, Лопез-Цастејон Г, Бландиззи Ц, Форнаи М. Цаноницал анд атипицал НЛРП3 инфламмасоме активација на раскрсници имунолошке толеранције и упале црева.преимуна.2017;8:36.
Ли Л, Ванг КСЦ, Гонг ПТ, Зханг Н, Зханг Кс, Ли С, ет ал.РОС посредована активација инфламасома НЛРП3 укључена је у одговор на инфекцију Н. цанинум.Вектор паразита.2020;13:449.